тривоги

  • реферат
  • ВСТУП
  • МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
  • предметів
  • наркотики
  • Тест на примусове плавання
  • Тест підвіски хвоста
  • Тест на відкритому полі
  • Світло-темний дослідницький тест
  • Екстрений тест
  • EPM
  • Вимірювання гормону стресу
  • Статистичний аналіз
  • РЕЗУЛЬТАТИ
  • Зниження депресивної поведінки у мишей з дефіцитом GAT1
  • Зниження поведінки, подібної до тривожності, у нокаутованих мишей GAT1
  • Вимірювання гормону стресу
  • ОБГОВОРЕННЯ

реферат

Депресія і тривога вражають мільйони людей різного віку, рас, релігій та доходів. Однак молекулярна основа розвитку цих розладів залишається в основному невідомою. Зростаючі дані свідчать про те, що система γ-аміномасляної кислоти (ГАМК) є важливою у патогенезі психологічних захворювань, включаючи тривогу та депресію. Дослідження з використанням магнітно-резонансної спектроскопії дозволяють припустити, що однополюсна депресія пов'язана зі зниженням рівня ГАМК в корі. Антидепресанти та засоби, що стабілізують настрій, також підвищують рівень ГАМК в корі та покращують дефіцит ГАМК у пацієнтів із розладами настрою (Krystal et al, 2002). Рецептори ГАМК, включаючи рецептори ГАМК А і ГАМК В, зазвичай вважаються мішенями для лікування психічних захворювань (Kalueff and Nutt, 1996). Однак препарати, що застосовуються для такого лікування, мають побічні ефекти (Johnston, 1996; Tsang and Xue, 2004). Дослідження на тваринах з інгібіторами поглинання ГАМК показали значні анксіолітичні ефекти, вказуючи на те, що модуляція поглинання ГАМК може бути потенційною мішенню для лікування психічних розладів (Sayin et al., 1992; Schmitt and Hiemke, 1999).

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

предметів

наркотики

Амітриптилін, іміпрамін, флуоксетин та буспірон були придбані у Sigma-Aldrich. Тіагабін був добрим подарунком від Науково-дослідного центру біотехнологій Celstar у Шанхаї. Діазепам був придбаний у Shanghai Jiufu Pharmaceutical Co., Ltd. Ці ліки розчиняли у фізіологічному розчині перед введенням.

Тест на примусове плавання

Мишей поміщали в циліндр з оргскла (внутрішній діаметр 10 см, висота 50 см), наповнений водою 25-26 ° C (висота 10 см). Поведінку тварин оцінювали вручну, а час нерухомості вимірювали протягом 5 хвилин експериментів. Миша вважалася нерухомою, коли вона залишалася плавати у воді, для чого потрібні лише рухи, необхідні для утримання голови над водою (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Porsolt et al., 1977a).

Тест підвіски хвоста

Тваринам вводили внутрішньочеревно об’єм 10 мл/кг носія (фізіологічний розчин) або антидепресанту. В якості антидепресантів використовували амітриптилін (10 мг/кг), іміпрамін (5 мг/кг) та флуоксетин (20 мг/кг). Через сорок хвилин миша була індивідуально підвішена хвостом до металевого стрижня. Стрижень кріпили на 50 см над поверхнею столу, покритою м'якою тканиною, у приміщенні, захищеному від шуму. Кінчик мишачого хвоста кріпився до стрижня клейкою шотландською стрічкою. Тривалість тесту становила 5 хвилин. Час нерухомості підвішених на хвості мишей вимірювали, як описано раніше (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Steru et al., 1985).

Тест на відкритому полі

Тест на відкритих полях проводився відповідно до опублікованих звітів (Holmes et al., 2003a, 2003b; Mathis et al., 1994). Відкритим полем була квадратна арена (50 × 50 × 50 см3) з прозорими стінами та підлогою з оргскла, яскраво освітленою флуоресцентним стельовим світлом (1,5 мкмоль/м2/с). Мишей поміщали в центр ящика і дозволяли вільно досліджувати протягом 10 хвилин. Мишей захоплювали за допомогою відеокамери, встановленої над підлогою, і аналізували за допомогою системи відеоспостереження (аналітичний аналізатор Морріса, V 1.1 з використанням BGB). Визначений "край" арени має ширину вздовж стіни 8 см, а "середнє" поле визначається як середня площа 20 × 20 см 2 відкритого поля, приблизно 16% від загальної площі.

Світло-темний дослідницький тест

Світло-темний скринінг проводили, як описано раніше (Crawley, 1981; Holmes et al., 2003a, 2003b). Апарат складався з поліпропіленової клітки (32 × 16 × 16 см 3), розділеної на два відділення (темну та світлу) перегородкою з невеликим отвором (8 × 5 см 2) на рівні підлоги та обладнаною інфрачервоним датчиком, який використовується для контролю кількості проходів. і часу, проведеного в кожній камері для кожної миші. Під час цих експериментів стельові світильники були вимкнені. Легка половина маятникової коробки була відкритою, прозорою і освітленою настільною лампою (100 Вт). Мишей окремо розміщували в центрі світлового відсіку, зверненого в сторону від перегородки, і дозволяли вільно досліджувати прилад протягом 5 хвилин. Було зафіксовано кількість переходів світло - темно між двома відділеннями та загальний час перебування у темному відділенні.

Екстрений тест

Екстрене випробування проводили, як було описано раніше (Holmes et al., 2003b; Smith et al., 1998; Takahashi et al., 1989). Пристрій складався з непрозорого чорного оргскла (16 × 16 × 19 см3) з вихідним отвором (6 × 4 см2) з одного боку на рівні підлоги. Це "укриття" було розміщено у відкритому полі (50 × 50 × 50 см3), яскраво освітленому флуоресцентним стельовим світильником, з виходом, що виходить на відкрите поле (паралельно одній стіні відкритого поля). Мишей спочатку помістили в притулок на 5-хвилинну звичку із закритим виходом. Потім отвір відкрили, щоб миші могли покинути притулок і досліджувати відкрите поле протягом 5 хвилин. Для кожної миші реєстрували затримку, що з’явилася з притулку, час перебування поза притулком та переходи на відкритий простір.

ЕРМ проводили, як описано раніше (File, 2001; Holmes et al., 2003a; Lister, 1987). Апарат складався з двох відкритих плечей (25 × 8 см2) і двох закритих плечей (25 × 8 × 12 см3), що виходили із загальної центральної платформи (8 × 8 см2). Маленькі підняті пір’я (0,5 см) по краях розкритих рук не дозволяли тваринам ковзати. Пристрій був побудований з поліпропілену та оргскла (біла підлога, прозорі стіни) і піднятий на висоту 50 см над підлогою. Мишей звикали до кімнати для випробувань за 2 дні до випробування і попередньо ретельно обробляли двічі на день, щоб зняти нервозність. Для експериментів з лікуванням наркотиків мишам вводили внутрішньоочеревинно 10 мл/кг носія (фізіологічний розчин) або ліки, буспірон (1 мг/кг), діазепам (1 мг/кг) та тіагабін (8 мг/кг), за 40 хвилин до тест. EPM. Мишей окремо розміщували на центральній площі, зверненій до розкритої руки, і дозволяли вільно досліджувати прилад під рівномірним світлом (1,5 мкмоль/м 2/с) протягом 10 хвилин. Мишей було захоплено за допомогою відеокамери, встановленої над лабіринтом, та проаналізовано за допомогою системи відеоспостереження (розбійний аналізатор Морріса. У 1.1 за допомогою BGB). Розкриті і зімкнуті руки (всі чотири лапи в плечі) відзначив досвідчений спостерігач.

Вимірювання гормону стресу

Кров збирали у обезголовлених мишей відразу після 10 хвилин фізичного обмеження (15 хв обмеження в конічній трубці об'ємом 50 мл) або відпочинку в домашній клітці (0900-1000) і центрифугували через збірку для збору сироватки при 1000 г протягом 15 хв. і зберігали при -20 ° C до використання. Вимірювання кортикостерону проводили в сироватці з використанням імунологічного аналізу кортикостерону (R&D Systems) відповідно до інструкцій виробника.

Статистичний аналіз

Середні значення та SE розраховували для кожної групи, і групи порівнювали за допомогою одностороннього ANOVA з подальшим t-тестом. p +/+, n +/- та n -/- .

РЕЗУЛЬТАТИ

Зниження депресивної поведінки у мишей з дефіцитом GAT1

У цьому дослідженні для оцінки тенденції до депресивної поведінки в генотипово різні групи мишей. Обидві експериментальні схеми засновані на спостереженні, що коли гризунів змушують потрапити в аверсивну ситуацію, з якої їм не вдається врятуватися, вони перестають намагатися врятуватися і стають нерухомими. Антидепресанти зменшують час нерухомості в цих аналізах (Porsolt, 2000; Steru et al., 1987), припускаючи, що ці методи можна використовувати для перевірки поведінки мишей, пов'язаної з депресією. У випробуванні примусового плавання, як показано на малюнку 1а, час нерухомості для мишей GAT1 -/- був значно нижчим, ніж час для тварин GAT1 +/- та GAT1 +/+ (F (2, 33) = 63, p -/- порівняно з мишами GAT1 +/+ (F (2, 16) = 16, p +/+ та GAT1 +/−, але не у мишей GAT1 -/-. Однак подібна реакція на інший інгібітор трициклічного поглинання, іміпрамін у всіх трьох групах (рис. 1b). Ці дані свідчать про те, що довгострокові зміни GABAergic гомеостазу впливають на депресивно-залежну поведінкову тенденцію мишей з можливою участю серотонінергічної системи.

Миші GAT1 -/- демонстрували знижену поведінку, подібну до депресії, під час тесту на примусове плавання та тесту на підвіску хвоста. а) Випробування на примусове плавання (n = 12 на групу). Поведінку відмінних за генотипом мишей вимірювали під час 5-хвилинного тесту на примусове плавання. Час нерухомості у диких, гетерозиготних та гомозиготних мишей становив 159,4 ± 8,7 с; 98,3 ± 7,6,6 с; 13, 6 ± 5, 1 с. *** p +/+ = 6, n +/− = 7, n -/- = 6) або 10 мг/кг амітриптиліну (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) або 5 мг/кг іміпраміну (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) або 20 мг/кг флуоксетину (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5), як описано в Матеріали та методи. Час нерухомості вимірювали під час 5-хвилинного випробування підвіски хвоста. ## p ### p * p ** p *** p -/- провів більше часу в центральній зоні та зробив більше входів (F (2, 51) = 3, 79, p = 0, 029), ніж дві інші миші-генотипи. Тим часом миші GAT1 -/- демонстрували гіперактивність та підвищену моторику. Цей фенотип проявився як значне збільшення часу зміни (F (2, 51) = 26, 3, p -/-. Також було значно більшим числом аберацій у мишей GAT1 -/- (F (2, 51) = 7, 63, p = 0,002).

Стіл в натуральну величину

Оскільки результати експериментів на вільних полях свідчать про те, що нокаут GAT1 призводить до зменшення поведінки подібної тривожності, ми вирішили підтвердити ці спостереження додатковими тестами.

Парадигма обстеження світло-темно, яка базується на вродженій відразі гризунів до яскраво освітлених ділянок та на спонтанній дослідницькій поведінці тварин, використовується в першу чергу для виявлення анксіогенної поведінки (Hascoet et al, 2001). GAT1 -/- миші проводили значно менше часу в темній кімнаті, ніж миші дикого типу (F (2, 43) = 8,38, p

Миші GAT1 -/- демонстрували знижену поведінку, схожу на тривогу, під час тестування екрану та виявлення світла та темряви. а) У тесті світло-темно (n +/+ = 17, n +/− = 15, n -/- = 14). Миші GAT1 -/- виконували кілька переходів світло-темно. б) Миші GAT1 -/- проводили менше часу в темному відділенні, ніж миші GAT1 +/+. в) У тесті на формування (n +/+ = 6, n +/− = 8, n -/- = 7). Миші GAT1 -/- краще захищають переходи у відкритому полі. (d) Миші GAT1 -/- проводили більше часу поза притулком, ніж миші GAT1 +/+. д) Перший раз, коли ми залишаємо притулок мишей GAT1 -/-, це довше, ніж у мишей GAT1 +/+, але різниця несуттєва. ** р *** р +/- миші.

Повнорозмірне зображення

Результати екстреного випробування наведені на малюнку 2в-д. Спостерігався значний генотипічний ефект на переходи на відкритому полі та відсоток часу, проведеного поза укриттям, але не на затримку, яка спочатку залишала притулок (F (2, 18) = 0,45, p = 0,65). Односторонній аналіз ANOVA показав, що миші GAT1 -/- робили більше переходів у відкритому полі (F (2, 18) = 6,52, p = 0,007) і проводили більше часу поза корпусом (F (2, 18) = 10, 9 ), p -/- проводив більше часу у відкритій руці (F (2, 35) = 42, але p -/- миші мали менший вплив на його поведінку у збільшеному тесті плюс лабіринт (Рисунок 3).

Нормальний і викликаний стресом рівень кортикостерону в сироватці мишей GAT1 -/-. Мишей GAT1 +/+ та GAT1 -/- виймали з домашньої клітки (наївними) або піддавали фізичному стримуванню протягом 10 хв. Кров відбирали у мишей негайною обезголовленою кровотечею (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5). Стовпчики та стовпці представляють середнє значення ± SEM. ** р +/- миші.

Повнорозмірне зображення

ОБГОВОРЕННЯ

ГАМК є найважливішим гальмівним нейромедіатором у центральній нервовій системі (ЦНС), а ГАМК-ергічні системи відіграють важливу роль у патофізіології депресії та тривоги. Магнітно-резонансна спектроскопія показала, що однополярна депресія пов’язана зі зниженням рівня ГАМК в корі у пацієнтів (Krystal et al, 2002). Крім того, тіагабін, інгібітор GAT1, використовується для лікування тривожних розладів (Crane, 2003; Lydiard, 2003; Schaller et al., 2004; Schmitt and Hiemke, 1999). Ці спостереження служать обґрунтуванням для вивчення змін поведінки настрою у мишей GAT1 - /. - .

Тести на примусове плавання та підвіски хвоста - це найбільш часто використовувані моделі тварин для скринінгу антидепресантів. Нерухомість, ставлення, що відображає стан `` поведінкового відчаю '', коли тварини більше не рятуються, асоціюється з депресією, а антидепресанти скорочують час, протягом якого тварини нерухомі (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Borsini et al. та ін., 1988; Порсольт та ін., 1977а). У нашому поточному дослідженні ми виявили значно зменшений час нерухомості для мишей GAT1 -/- в обох аналізах. Ці поведінкові ефекти подібні до тих, що спостерігаються нами та іншими дослідниками у тварин дикого типу, які отримували антидепресанти, такі як амітриптилін, іміпрамін та флуоксетин (рис. 1b) (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Borsini et al., 1988) . Порсольт та ін., 1977а).

Для подальшого дослідження ролі GAT1 у поведінці тривожності було обрано три анксіолітичні препарати: буспірон, діазепам, тіагабін, які мають різні молекулярні мішені, для вивчення їх впливу на мишей, мутованих GAT1, за допомогою моделі поведінки EPM. Діазепам і тіагабін діють на систему GABAergic. Діазепам є агоністом на сайтах BDZ для підвищення струму С1 ГАМК A і є бензодіазепіном із знижуючими ЦНС властивостями (Banfi et al, 1982; Atack, 2005). Тіагабін гідрохлорид, селективний інгібітор зворотного захоплення ГАМК, підвищує тонус ГАМК через блокаду GAT1 (Nielsen et al., 1991; Rekling et al., 1990). Буспірон, частковий агоніст рецептора серотоніну 1А, також має антагоністичну дію на D (2) -допамінові та α2-адренергічні рецептори (Gobert et al., 1999). Лікування дикого типу цими препаратами суттєво збільшило активність у відкритих обіймах аналізу ЕРМ. Однак миші без GAT1 -/- не були чутливими до поведінкових ефектів цих препаратів.

У багатьох пацієнтів з основними депресивними епізодами дерегульований циркадний контроль кортизолу зі значно вищими рівнями крові, ніж у здорових людей (Strickland et al., 2002; Urani et al., 2005). Підвищений рівень кортизолу у пацієнтів з депресією зазвичай нормалізується після успішного лікування антидепресантами (Wolkowitz et al, 1993, 1999). Попередні дослідження показали, що класичні бензодіазепіни знижують активність кори кори ГПА кори (Mikkelsen et al., 2005), а низький рівень кортикостерону в сироватці крові може бути пов'язаний зі зниженням тривожності (Ferguson et al., 2004; Smith et al., 1998) . Ми вивчили функцію осі HPA у мишей GAT1 -/-, вимірюючи рівень кортикостерону після фізичного стримувального стресу та під час нормальної активності. Рівні кортикостерону були нижчими у мишей GAT1 -/-, ніж у мишей дикого типу під час нормальної активності. Однак різниці між стресовими генотипами не було. Це свідчить про те, що функція осі HPA у мишей GAT1 -/- була змінена в звичайних умовах, але її чутливість до стресу може не змінитися.

Нарешті, наші результати підтверджують гіпотезу про те, що регуляція функції GAT1 впливає на поведінку, подібну до тривоги, та депресію. На основі наших спостережень у мишей GAT1 -/- та GAT1 +/− з відсутністю та низькою експресією GAT-1, наші дані надають інформацію про внесок експресії GAT1 у прояв цих психічних розладів. Отже, препарати, які можуть регулювати функцію або експресію GAT1 з подальшою модуляцією системи GABAergic, можуть мати терапевтичне значення при лікуванні цих психічних розладів. Миші GAT1 -/- можуть надати корисний інструмент для подальшого визначення фармакологічних ефектів антидепресантів та анксіолітиків та фармакогенетики депресії та тривоги.