предметів

реферат

Завершення проекту «Геном людини» та розробка геномного скринінгу зробили технологію мікрочипів важливим інструментом для вивчення генетичного впливу на етіологію психічних розладів 7. Попередні дослідження виявили, що гени в крові та тканинах головного мозку мають подібні моделі експресії 8, 9, і простіше виміряти експресію генів у крові, оскільки її можна отримати з мінімальною інвазивністю. Підходи до мікрочипів широко використовуються для дослідження нервово-психічних розладів, таких як шизофренія 10, біполярний розлад 11 та великий депресивний розлад (MDD) 12. Крім того, дані мікрочипів використовувались для пошуку нових генів та шляхів, які можуть бути пов’язані з етіологією психічних розладів. Однак, наскільки нам відомо, мікрочипи не використовувались для дослідження експресії генів у периферичній крові хворих на ОКР. У цьому дослідженні ми зосередились на виявленні генів (мРНК), які різницево виражались між пацієнтами з ОКР та здоровими контролерами за допомогою технології мікрочипів. Ми також провели аналіз збагачення генних онтологічних (GO) та Кіотської енциклопедії генів та геномів (KEGG) шляхів, пов'язаних з генами, для вивчення функцій диференційовано експресованих мРНК.

результат

Інакше виражена мРНК

Ми використовували мікрочипи для геномного сканування мРНК з мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) 30 пацієнтів з ОКР та 30 спарених здорових контролів.

Ми виявили загалом 51 диференційовано експресовану мРНК зі складчастою зміною ≥ 1, 5 і частотою хибнопозитивних

експресії

Вулканічний графік змін у профілях експресії генів цілого геному мононуклеарних клітин периферичної крові між пацієнтами з ОКР та здоровими контролерами. Всього виявлено 51 суттєво диференційовано експресовану мРНК із кратною зміною ≥1,5 та скоригованим Бонферроні значенням р

Heatmap Top 100 диференційовано експресованих генів, що дозволяють відрізнити хворих на ОКР та здорові контролі, отримані ієрархічним кластерним аналізом.

Повнорозмірне зображення

Функціональна анотація

Аналіз функціонального збагачення ГО показав, що 23 із 51 суттєво диференційовано експресованих мРНК збагачені з точки зору рибосомного білка, включаючи процес метаболізму клітинного білка, розвиток ендокринної підшлункової залози, вірусну транскрипцію, цикл вірусної інфекції, репродукцію вірусу, експресію генів, трансляцію РНК та трансляцію . Гени, що кодують NDUFA4 (NADH-дегідрогеназа (убихінон) 1 альфа-підкомплекс), NDUFA5 і NDUFA1, значно збагатилися мітохондріальним переносом електронів і NADH до убихінону, а гени, що кодують NDUFA4, COX7C (цитохромно-резектаза цитохрому) транспорт водню.

Аналіз доріжки KEGG 51 суттєво диференційовано експресованих мРНК також виявив 23 мРНК, збагачені для рибосоми; NDUFA4, NDUFA5, COX7C, NDUFA1 та UQCRB, які значно збагачені хворобою Паркінсона, хворобою Альцгеймера, хворобою Хантінгтона та безалкогольною жировою хворобою печінки та COX7C, CACNB4 (кальцієвий канал, залежна від напруги субодиниця, субодиниця бета 4), бета 4 субодиниці значно збагатилися скороченням серцевого м’яза (Таблиця 2).

Стіл в натуральну величину

Перевірка ПЛР у режимі реального часу (qRT-ПЛР)

Для перевірки результатів аналізу мікрочипів ми відібрали 10 диференційовано експресованих транскриптів мРНК для перевірки методом qRT-PCR, а саме RPS3A, RPL34, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7, RPL26, ZNF721 та COMMD6. Результати qRT-PCR показали, що RPL34 регулюється зниженням відповідно до аналізу мікрочипів, тоді як RPS3A, RPS24, RPL23, RPS7, RPL41, RPL7 і RPL26 регулюються вгору (Таблиця 3). Не виявлено, що ZNF721 та COMMD6 диференційовано експресуються між OCD та здоровими контролями за допомогою qRT-PCR (Таблиця 3).

Стіл в натуральну величину

обговорення

Наскільки нам відомо, це перше дослідження, яке виявило диференційовано експресовані гени серед пацієнтів із ОКР та здоровими контролерами за допомогою технології мРНК мікрочипів. Ми виявили 45 мРНК, які були зниженими та 6 мРНК, які були підвищеними у пацієнтів з ОКР.

Попередні дослідження показали, що важливі гени, що беруть участь у патофізіології ОКР, були пов'язані із серотоніновою, дофаміновою та глутаматною системами 13, 14, 15; однак ми не виявили цих генів у цьому дослідженні. Ці відмінності можна пояснити різними використовуваними методами дослідження. У попередніх дослідженнях генні підходи-кандидати 13, 14, 15 використовувались для дослідження генів, пов'язаних з OCD, тоді як мікрочипи використовувались для виявлення генів, пов'язаних з OCD. Аналізи GO та KEGG виявили 23 диференційовано експресованих мРНК, збагачених на терміни та шляхи, пов’язані з рибосомним білком (RP).

Рибосоми - це субклітинні органели, що складаються з двох різних субодиниць 17, і кожна субодиниця містить різну кількість рибосомних РНК (рРНК) та РП. Великі 60S рибосомні субодиниці збираються з малими 40S субодиницями, утворюючи 80S рибосоми. У ссавців рибосомний комплекс нуклеопротеїдів 80S містить 4 рРНК та приблизно 80 білків, з більш ніж 150 асоційованими білками та приблизно 70 малими ядерними РНК 18. Невелика субодиниця 40S опосередковує взаємодію між тРНК і мРНК і вибирає правильну тРНК для центру декодування. Велика субодиниця 60S містить пептидилтрансферазний центр і забезпечує вихідний тунель для зростаючого зароджується поліпептидного ланцюга. Функція рибосом у трансляції мРНК у білки та трансляції сильно залежить від білків рибосоми (RP) 19. RP є дуже консервативними, тому кількісні дефіцити призводять до зниження синтезу білка 20, що може впливати на різноманітні патологічні процеси, такі як рак 21, генетичне захворювання 22 та вірусна інфекція 23. .

Члени сімейства білка пальців цинку (ZNF) мають мотиви зв'язування ДНК і РНК, а амінокислоти зібрані в єдину структурну одиницю навколо атома цинку 32. Білки ZNF мають широкий спектр функцій, включаючи транскрипцію та розпізнавання ДНК 33. ZNF804A визначено одним із найвизначніших генів ризику, пов'язаних з психічними розладами 34, 35. У цьому дослідженні ми виявили, що мРНК ZNF721 була знижена у пацієнтів з ОКР.

Білки COMMD (домен метаболізму міді), що містять білки (також відомі як MURR1), були виявлені близько 10 років тому, і на сьогодні відомо 10 білків COMMD. Наприклад, вони беруть участь у гомеостазі міді, регуляції фактора транскрипції NF-κB (ядерний фактор κB) та проліферації клітин 36. COMMD6, повсюдно експресований малий розчинний білок та ендогенний інгібітор NF-κB, пов'язує ДНК та активує транскрипцію 37, 38. Активація NF-κB була пов’язана з деякими нейродегенеративними захворюваннями як наслідок нейротоксичної ролі NF-κB 39. Зниження регуляції COMMD6 або лікування іншим інгібітором NF-κB NFκBIA може посилити активацію NF-κB, що може погіршити функцію гіпокампа у осіб з OCD.

Субодиниця дегідрогенази NADH (убихінон) 1 альфа-підкомплекс (NDUFA4) є 14-ю субодиницею оксидази цитохрому с. NDUFA4L2 інгібує окислювальний комплекс фосфорилювання I, кінцевий комплекс кисню, що отримує ферментний комплекс мітохондріального дихального ланцюга, для опосередкування переходу до гліколізу в зростаючих клітинах і тканинах раку 40. Надмірна експресія NDUFA4, що спостерігається в клітинах раку легенів, на відміну від його зниженої регуляції при хворобі Альцгеймера. Попереднє ціле дослідження геному виявило, що NDUFA4 асоційований із хворобою Альцгеймера і був визначений як потенційний біомаркер захворювання 41. Убіхінол-цитохром с-редуктазний зв’язуючий білок (UQCRB) важливий для стабільності мітохондріального комплексу III, транспорту електронів, клітинного зондування кисню та ангіогенезу. NDUFA, COX7C та UQCRB беруть участь у дихальному ланцюзі мітохондрій, і всі три були знижені у пацієнтів з OCD. Однак взаємозв'язок між дисфункцією мітохондрій та ОКР обмежений.

Гени, що кодують рецептори гарячого смаку типу 2 (TAS2R30 і TAS2R46), регулювались вгору при OCD. TAS2R експресуються широко поза мозку, але їх зв'язок з OCD невідомий.

CACNB4 є однією з керованих напругою субодиниць бета-каналу, які нещодавно були встановлені, що функціонують у збудливості нейронів та транскрипції генів 42. CACNB4 був надмірно експресованим при шизофренії і був пов'язаний з депресією струмів кальцію, які контролюють формування та стабілізацію спинного мозку, а виявлено, що підвищена експресія CACNB4 призводить до низьких втрат хребта 43. Існує гіпотеза, що підвищення регуляції CACNB4, виявлене в нашому дослідженні, може бути пов'язане з патогенезом ОКР.

У нашому дослідженні слід зазначити кілька обмежень. По-перше, розмір вибірки був відносно невеликим, що могло зменшити статистичну потужність порівняння експресії генів між ОКР та здоровими контролями. Були розбіжності у напрямку генних змін між аналізом мікрочипів та валідацією qRT-PCR, ймовірно, тому, що для валідації використовували різні зразки, а пацієнти знаходились на різних стадіях розладу та в різних схемах лікування.

Нарешті, ми виявили змінені закономірності експресії генів у пацієнтів з ОКР та підкреслили роль генів RP у патогенезі ОКР.

Матеріали і методи

Профілі учасників

Це дослідження було проведено в Центрі психічного здоров'я Усі в Нанкінському медичному університеті, Усі, провінція Цзянсу, Китай. Тридцять пацієнтів з ОКР та 30 осіб, які контролювали статевий та віковий контроль. В обох групах було 20 чоловіків та 10 жінок. Середній вік для пацієнта та контрольної групи становив 28,8 ± 12,0 років (діапазон 15–60 років) та 28,8 ± 11,1 років (діапазон 17–56 років). Діагноз ОКР був підтверджений структурованим клінічним інтерв'ю щодо розладів DSM-IV (SCID). Хворі на шизофренію, МРЗ, коморбідне розлад I осі або неврологічне захворювання в анамнезі були виключені. Здорові огляди, які не мали психічних захворювань або серйозного здоров'я, отримували від місцевої громади.

Це дослідження було схвалено Комітетом з питань етики з питань психічного здоров’я Усі в Нанкінському медичному університеті. Кожен учасник надав письмову інформовану згоду. Усі методи дослідження відповідали Гельсінкській декларації 1975 року.

Забір крові та виділення PBMC

Периферичну кров збирали у 10 мл пробірки для зберігання вакцинації, що містять ЕДТА, і негайно зберігали при 4 ° C. Цілу кров обробляли протягом 2 годин після забору.

Для відокремлення мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) використовували центрифугування з градієнтом щільності Фіколля. Коротко, розведену фізіологічним розчином кров шарували через Фікол, потім центрифугували для відокремлення еритроцитів, PBMC та плазми. PBMC обережно і повністю відсмоктували із шару Фіколя і переносили в нову пробірку, яку двічі промивали.

Виділення загальної РНК

Загальну РНК екстрагували з РВМС з використанням реагенту TRIzol (Invitrogen, США) відповідно до інструкцій виробника та кількісно визначали за допомогою NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). Цілісність РНК (RIN) оцінювали за допомогою Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

Середнє значення (SD) RIN для всіх зразків становило 9,29 (0,48). Співвідношення 28S до 18S рРНК становило 2,79 (0,35), а RIN ≥7. Для 28S: 18S значення RIN> 0,7 вважалось таким, що відповідає прийнятній якості РНК згідно з інструкціями виробника.

мРНК мікрочип, маркування, гібридизація та сканування

Загальну РНК мітили повної мРНК та набором Hyb (Agilent Technologies) та гібридизували з мікрочипом lncRNA людини 4, 04 x 180 K (Agilent Technologies). Мікрочіп містить 30656 зондів для мРНК людини, усі вони були отримані з авторитетних баз даних, включаючи RefSeq Build, Ensemble Release, GenBank та Unigene Build. Загальна РНК (по 200 нг кожна) була зворотно транскрибована в дволанцюгову кДНК, потім синтезована в кРНК і позначена ціанін-3-CTP. Мічені кРНК гібридизували до мікрочипів. Після промивання чіпи сканували за допомогою сканера мікрочипів Agilent (G2505C, Agilent Technologies).

Валідація методом qRT-ПЛР

Загальну РНК виділяли з РВМС з додаткових 26 пар OCD та здорових контролів, використовуючи реагент TRIzol (Invitrogen) з обробкою колонки DNase I, як описано виробником. кДНК синтезували за допомогою набору РНК-до-кДНК високої ємності (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. QRT-ПЛР проводили з використанням праймерів, перелічених у таблиці 4, та SYBR® Select Master Mix (Invitrogen) на ПЛР-машині в реальному часі 7900HT (Applied Biosystems, США) з наступними циклами: 2 хвилини при 50 ° C, 2 хвилини при 95 ° С, потім 40 циклів по 15 с при 95 ° С, 60 с при 60 ° С, а потім стандартний протокол дисоціації, щоб переконатися, що кожен амплікон є окремим продуктом. Всі кількісні показники були нормалізовані до ACTB. QRT-ПЛР проводили в трьох примірниках для кожного незалежного зразка.

Стіл в натуральну величину

Аналіз даних

Програмне забезпечення Agilent Feature Extraction (версія 10.7.1.1; Agilent Technologies) було використано для аналізу зображень зображень для отримання вихідних даних. Для аналізу вихідних даних використовувався GeneSpring (GX v11.5.1; програмний пакет Agilent Technologies). Вихідні дані спочатку нормували за допомогою квантильного алгоритму, а потім аналіз диференціальних виразів за допомогою t-критерію Стьюдента. Для подальшого аналізу даних були відібрані зонди, які мали принаймні 1 із 2 станів і мали 75% симптомів у "Р". Диференціально експресовані гени були ідентифіковані на основі зміни кратності, а також значення р, обчисленого за допомогою t-критерію Стьюдента. Пороговим значенням, встановленим для регульованих вгору та вниз генів, була кратна зміна ≥ 1, 5 та частота помилкових відкриттів ≤ 0,05.

Рівні експресії MRNA між пацієнтами з ОКР та здоровими контролями аналізували, використовуючи аналіз Mann-Whitney U.

Для кореляції диференційовано виражених мРНК з біологічними процесами ми анотували мРНК, використовуючи терміни GO та шляхи KEGG (//www.genome.ad.jp/kegg/), щоб визначити їх потенційну роль. Потім ми провели ієрархічний кластерний аналіз, щоб показати відмінні закономірності експресії генів між ОКР та здоровими групами. Чим нижче значення р, тим значнішою є кореляція; рекомендована межа значення р становила 0,05.

Наявність даних

Усі дані мікрочипів зберігалися в Онібусі генної експресії (GEO) у Національному центрі біотехнологічної інформації NIH під серійним номером GSE78104.

Дякую

Щиро дякуємо пацієнтам та здоровим волонтерам за участь, а також медичному персоналу, який бере участь у відборі проб. Ця робота була підтримана Національним науковим фондом Китаю (81101008) та Національним науковим фондом провінції Цзянсу (13K2012546).

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.