предметів
реферат
Ожиріння та пов'язані з цим метаболічні захворювання зростають у всьому світі, тоді як безпечне та ефективне лікування ожиріння залишається невловимим. Оскільки споживання їжі та вага тіла контролюються центральною нервовою системою (ЦНС), розуміння складних механізмів ЦНС, що регулюють енергетичний гомеостаз, є важливим для відкриття успішних препаратів проти ожиріння.
Бічний гіпоталамус (ЛГ) історично відомий як критичний "центр харчування" та сильний координатор руху їжі, пиття та фізичних вправ. Ключова роль цього ядра в контролі годування, мабуть, найбільш яскраво проілюстрована глибокою афазією, викликаною двосторонніми ураженнями ЛГ. 1, 2, 3, 4 На відміну від цього, стимуляція ЛГ викликає дієту навіть у насичених щурів. Це ядро також розроблено як інтерфейс між гомеостатичним та гедонічним контролем подачі. Щури нетерпляче натискають на важіль, щоб стимулювати рівень ЛГ, припускаючи, що сама активація ЛГ є корисною. 6, 7, 8
Їжа може бути дуже ефективним корисним стимулом. Споживання їжі та винагорода частково регулюються різними та частково перекриваються ядрами мозку: ділянками, які реагують на гормональні та метаболічні сигнали, що надходять з периферії та деінде в мозку. 9, 10 Мезолімбічні нейроциркулятори, особливо вентральна тегментальна зона (VTA) та її дофамінергічні проекції в ядро акумулятора (NAc), приділяли значну увагу при нервовому контролі за винагородою їжі. 11, 12, 13 Однак ЛГ насправді є найсильнішим самостимулюючим центром головного мозку, і оскільки щури, що голодують/обмежуються їжею, самостимулюються навіть більше, ніж щури, яких годують, взаємодія між метаболічним статусом та винагородою може вимагати обробки цим мозком ядро.7, 14, хоча також можливо, що стимуляція пучка середнього мозку, який пов'язує VTA з NAc і перетинає LH, може сприяти посиленню ефектів внутрішньочерепних досліджень самостимуляції. ЛГ іннервується глюкагоноподібними нейронами пептиду-1 (GLP-1) та рецепторами GLP-1R (GLP-1R), експресованими в ЛГ. 16 Можливий вплив цього Повідомлення на оплату праці значною мірою не вивчений.
Матеріали і методи
Самців і самок щурів Спраг-Доулі (віком 5 тижнів після прибуття, річка Чарльз, Сульцфельд, Німеччина) поміщали в 12-годинний цикл світло/темрява (світло о 07:00) в окремі клітини з доступом до фунту лібіту. Глобальна 16% білкова дієта на гризунах (2016), Envigo, Хантінгдон, Великобританія) та вода, якщо не зазначено інше. Всі дослідження проводились з етичного дозволу Комітету з захисту тварин Університету в Гетеборзі відповідно до законодавчих вимог Європейського Співтовариства (Декрет 86/609/ЄЕС). Були зроблені всі зусилля, щоб мінімізувати страждання.
наркотики
Ex4 та антагоніст GLP-1R екзендін-9 (Ex9) були придбані у Tocris (Брістоль, Великобританія), розчинені у штучній лікворовій рідині (Tocris; використовується як транспортний засіб) та зберігались у вигляді аликвот при -20 ° C.
Канюляція мозку
Напрямні канюлі імплантували в ЛГ, як описано вище (детальніше див. Додаткову інформацію). Завдяки вибраним координатам, наші маніпуляції/ін’єкції послідовно досягали центральної, латеральної та дорсальної ЛГ. Ін’єкції також можуть досягати зона incerta; однак, на відміну від LH, ця область не експресує GLP-1R 16 (додатковий малюнок S1).
Експлуатаційне кондиціонування
Процедура хірургічного кондиціонування використовується для оцінки мотивації отримувати винагороду, в даному випадку харчову винагороду у вигляді гранул сахарози (45 мг TestDiet, Річмонд, Індіана, США). Навчання та тестування проводились, як описано вище 30, 31 та у додатковій інформації. Всі тести оперативної реакції проводились із прогресивним співвідношенням (PR).
Вплив фармакологічної активації або блокади LH GLP-1R на споживання їжі, масу тіла, фізичну активність та мотивовану їжею поведінку
Для перевірки ефектів активації GLP-1R щурам віком 11 тижнів вводили Ex4 (0, 05 або 0,15 мкг) або носій (штучна лікворна рідина), а оперативну реакцію на операцію тестували через 20 хвилин після ін’єкції. Крім того, вплив естрольного циклу на активацію LH GLP-1R оцінювали в окремій групі 8-тижневих самок (див. Додаткову інформацію). В експериментах, що вивчали ефект блокади GLP-1R, щурів старше 11 тижнів голодували протягом ночі, потім давали борошно протягом 20 хвилин і вводили Ex9 (10 мкг) відразу після їжі. Ця конструкція була модифікована з Hayes et al. 32 і використовується для індукції вивільнення ендогенного GLP-1 у контрольоване харчування. Щурів тестували в хірургічному фітнес-завданні через 10 хвилин після ін’єкції. Пошук їжі оцінювали, як кількість голів голови вводили в камеру годування протягом 60-хвилинного оперативного сеансу. Через 1 та 24 години після оперативного обстеження вимірювали споживання чуфу. Кожне лікування було збалансованим, де кожен стан був розділений на 4-денний період. Рухову активність вимірювали за допомогою горизонтальних інфрачервоних променів в операційних камерах (Med-Associates, Georgia, VT, USA).
Нокдаун GLP-1R
Коротка шпилька РНК (shRNA), орієнтована на транскрипти GLP-1R, використовувалася для придушення експресії GLP-1R у ЛГ (докладніше див. Schimdt et al. 24). Попередні дослідження in vitro показали - 88% збиття експресії GLP-1R у клітинній лінії нейронів щурів, трансфікованих цією РНК. Для придушення експресії GLP-1R in vivo цю послідовність shRNA клонували та упаковували в аденоасоційований вірус (AAV) (серотип 1; титр = 5,22e12) у співпраці з ядром вірусу в Університеті Пенсільванії. Показано, що ця конструкція зменшує експресію GLP-1R in vivo у VTA щурів на 50%. Як контроль використовували зелений флуоресцентний білок (GFP), що експресує AAV (титр = 5,0e12).
Для визначення функціональної значимості ендогенної передачі сигналів GLP-1R у ЛГ щурам хірургічно імплантували направляючу канюлю, орієнтовану на ЛГ, як описано вище. Як тільки щури досягли стабільної поведінки PR, мотивованої сахарозою (у віці 9 тижнів), експресуючий AAV GFP (AAV-GFP) або GLP-1R shRNA (AAV-GLP-1R-shRNA) вводили двобічно в ЛГ (0,5 мкл на півкулі протягом 5 хвилин). Мікроінжектори залишали на місці протягом 10 хвилин після інфузії, щоб забезпечити дифузію подалі від місця ін’єкції. Щури, відібрані для кожної групи лікування, були скориговані з урахуванням маси тіла, споживання їжі та показників підвищення їжі у PR.
Вагу тіла та споживання їжі вимірювали щодня після інфузії конструкції AAV, за винятком днів, коли застосовували голодування або обмеження їжі. Мотивацію введення сахарози визначали за графіком PR через 3, 7 та 10 днів після ін’єкцій AAV. 7 дня щурів голодували протягом ночі, щоб визначити, чи не змінився внесок сигналізації LH GLP-1R у мотивовану їжею поведінку в стані голодування.
Через три тижні після ін’єкцій вірусу було проведено два експерименти, що вимагали обмеження їжі: вимірювання рівня глюкози в крові натще, після чого пероральний тест на толерантність до глюкози (внутрішньочеревний тест на толерантність до глюкози; детальніше див. Додаткову інформацію) та експеримент натщесерце/годування.
Через чотири тижні після ін'єкції AAV жирову тканину зважили і мозок видалили. Мозок розтинали і збирали LH, NAc та NTS, щоб оцінити експресію GLP-1R за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (детальніше див. Додаткову інформацію). З кожного мозку брали корональний зріз, що містить ЛГ (10 мкм), щоб перевірити правильність місця ін’єкцій AAV шляхом візуалізації флуоресценції GFP (репрезентативне розташування показано на малюнку 4).
Друга менша група щурів (n = 20, 10 самців та 10 самок, вік 13 тижнів) була зарахована після першого дослідження, щоб визначити, чи існують гендерні відмінності в ефектах нокдауну LH GLP-1R, та контролювати щоденне споживання їжі і вага тіла без перерв у тестуванні, що вимагало обмеження на ніч у першої групи щурів. Крім того, ще одну групу самок щурів (n = 16) тестували для подальшої оцінки потреби в LH GLP-1R у молодих жінок, чий приріст маси тіла був швидшим, ніж у самок 13-тижневого віку; цим щурам було 9 тижнів на момент вливання AAV-shRNA.
Моніторинг вірусних шляхів та гібридизація in situ
Ін'єкції субодиниці холерного токсину В та гібридизацію in situ проводили, як описано вище. 33 Докладніше див. У Додатковій інформації.
Вплив Ex4 або харчування на експресію гена LH
Для оцінки ефекту активації GLP-1R на нейропептиди LH у нейронах використовували гіпоталамічні нейронні клітини, увільнені від чотирьох мишей-самців у віці 8 тижнів. Щоб визначити, чи були гени, які виявилися зміненими в безсмертній клітинній лінії гіпоталамуса, також експресувались у ЛГ in vivo та змінювались при вживанні жиру, їжі або сахарози, щурів піддавали відповідній дієті протягом 1 години щодня протягом 1 тижня. кожний інший день. Мозок видаляли, а ЛГ розтинали відразу після останнього годування. Потім експресія генів була проаналізована (детальніше див. Додаткову інформацію та додаткову таблицю). У кожній групі кормів була одна тварина, яка споживала 11, 12, 13 (малюнки 1f-m). Придушення споживання їжі також було дуже ефективним (F (2, 26) = 11, 10; P 
Гостра фармакологічна блокада латерального гіпоталамусового (ЛГ) глюкагоноподібного рецептора пептиду-1 (GLP-1R) збільшує приплив їжі, але не споживання їжі. Мікроін’єкція внутрішньо LH антагоніста GLP-1R, Exendin 9 (Ex9; 10 мкг), збільшила кількість отриманих нагород сахарози ( a, b ) та кількість важелів для винагороди ( c, d ) у графіку прогресивного коефіцієнта, без зміни активності неактивного важеля ( e, f ) у самців щурів. Подібним чином це лікування значно збільшило споживання їжі (кількість входів у дозатор їжі) у самців щурів ( g, h ). Жоден із цих параметрів не був змінений у самок щурів. Споживання їжі вимірюється як 1 ( i, j ) і 24 год ( k, л ) на прийом їжі жодна стать не впливала. Рухова активність також не зазнала значних змін ( м, n ). Дані виражаються як середнє значення ± sem n = 8-10 (самці щурів: м ) і n = 14 (самки щурів: f ). * P # P = 0,07.
Повнорозмірне зображення
- Завантажте слайд PowerPoint
Хронічне ослаблення GLP-1R, спрямоване на ЛГ, призводить до збільшення ваги, споживання їжі та підвищення їжі
Щоб визначити, чи необхідна ендогенна передача сигналів GLP-1R в ЛГ для контролю ваги, прийому їжі та мотивації підсилення їжі, AAV-GFP або AAV-GLP-1R-shRNA вводили двобічно безпосередньо до ЛГ. Це призвело до зменшення приблизно на 50% та 80% (чоловіків/молодших жінок та літніх жінок) експресії транскриптів GLP-1R у щурів, інфікованих AAV-GLP-1R-shRNA, порівняно з контролем (рисунок 4n, додаткові малюнки S8A). і Б). Цього лікування було достатньо для порушення нормальної маси тіла та регулювання харчування у 9-тижневих самців щурів, оскільки щури AAV-GLP-1R-shRNA набирали значно більшу вагу (F (23, 644) = 10, 69; P
50% у щурів LH, які отримували AAV-GLP-1R-shRNA (РНК із короткою шпилькою), порівняно з контролем ( n ). Корональний розділ головного мозку, що показує введенні контролю LH та AAV-GLP-1R-shRNA ( про ). Ядерне фарбування DAPI (4,6-діамідино-2-феніліндол) позначено синім кольором. Панелі ( стор a q ) показують зелені флуоресцентні білки, що експресують клітини в ЛГ. * P # P
обговорення
Наші дані демонструють, що, на відміну від попередніх висновків, GLP-1R в головному мозку, а особливо в ЛГ, є необхідним для регулювання маси тіла та жирових відкладень у чоловіків та жінок. Подібним чином вони необхідні для стримування поведінки винагороди за їжу у чоловіків. Беручи до уваги стійкі та стійкі зміни, отримані в результаті маніпуляції з одним геном у ЛГ, це ядро має величезний потенціал як для розвитку ожиріння, так і, можливо, для визначення стратегій контролю над переїданням.