Університет Гранади Офіційна докторська програма з біомедицини Біохімічна та функціональна характеристика фактора транскрипції та сплайсингу PRPF40B Soraya Becerra Ortiz López-Neyra Гранада Інститут паразитології та біомедицини, 2015

функціональна

Видавництво: Університет Гранади. Автор докторської дисертації: Сорая Бесерра Ортіс ISBN: 978-84-9125-072-2 URI: http://hdl.handle.net/10481/40006

Докторант СОРАЯ БЕКЕРРА ОРТІЗ та директор дисертації CARLES Mª SUÑÉ NEGRE під назвою БІОХІМІЧНА ТА ФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРУ ТРАНСКРІПЦІЇ ТА СПЛИЦІЇ PRPF40B: Підписуючи цю докторську дисертацію, ми гарантуємо, що робота виконана докторантом під вказівки директора дипломної роботи та, наскільки наші знання досягають, при виконанні роботи поважаються права інших авторів, на яких цитується, коли використовуються їх результати чи публікації. Гранада, 28 січня 2015 р. Директор докторської дисертації Підписано: д-р Карлес М. Суньє Негре Підписано: Сорая Бесерра Ортіс

функціональних аналізів ми показуємо, що PRPF40B також здатний активувати транскрипцію. Ми також показали, що мутації, пов'язані з мієлодиспластичним синдромом, різко знижують здатність активації транскрипції PRPF40B.

I. СКОРОЧЕННЯ 1 II. ВСТУП 7 1. ВИРАЖЕННЯ ГЕНІВ. ТРАНСКРИПЦІЯ 9 1.1 РНК-полімераза 9 1.2 RNAPII CTD 9 1.3 Стадії транскрипції 10 1.3.1 Ініціювання 10 1.3.2 Елонгація 10 1.3.2. Припинення 11 1.4 Регулювання транскрипції 12 2. ОБРОБКА мРНК 14 2.1 Сплайсосома 14 2.2 Визначення екзону 16 2.3 Альтернативне сплайсинг 17 2.4 Типи альтернативного сплайсингу 18 3. РЕГУЛЮВАННЯ СПЛІЦІНГУ 19 3.1. Елементи регулювання СНД 19 3.2. Елементи регулювання в транс 19 3.3 Регулюючі механізми сплайсингу 22 4. ТРАНСКРІПЦІЙНЕ ЗВ'ЯЗУВАННЯ І СПЛИНГУВАННЯ 25 4.1 Кінетична модель 25 4.2 Модель рекрутингу 28 4.2.1 Фактори транскрипції та сплайсингу 29 4.2.2 Білки з доменами WW та FF 31 5. ЯДЕР ЄВХАРІЙСЬКА КЛІТИНА 38 5.1 Ядерні вкраплення 39 5.1.1 Функція ядерних вкраплень 40 5.1.2 Склад ядерних вкраплень 41 5.1.3 Сигнальні домени до ядерних вкраплень 42 6. АПОПТОЗ 44 6.1 Внутрішній шлях 45

6.2 Внутрішній шлях 45 6.3 Каспази 46 7. АПОПТОЗ І СПЛИНГ 48 7.1 Регулювання фасу 49 8. АЛЬТЕРНАТИВНЕ СПЛИНУВАННЯ ТА ЗАХВОРЮВАННЯ 51 8.1 Типи змін при зрощенні 51 8.2 Альтернативне зрощення та нервова система 52 8.3 Альтернативне зрощення при раку 54 III. ЗАВДАННЯ 57 IV. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 61 1. ПЛАЗМІДИ 63 2. КЛІТИНИ КЛІТИН ТРАНСФЕКЦІЇ 65 2.1 Культури клітин 65 2.2 Трансфекції 66 2.3 Інфікування клітинних культур 67 3. ПРОЦЕДУРИ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ 68 3.1 Імунофлюоресценція 68 3.2 Екстракція РНК та RT-PCR 69 3.3 Екстракція загальної РНК для масивного аналізу 71 3.4 Спрямований мутагенез PRPF40B 72 3.5 Аналізи активності люциферази 72 3.6 Аналізи взаємодії білок-білок in vivo 73 3.7 Аналізи взаємодії білок-білок in vitro 74 4. ПРОЦЕДУРИ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ 74 4.1 Аналізи клітинної смерті та клітинного циклу 75 4.2 Додаток Аналіз V-зв’язку 75 4.3 Вимірювання активності каспази-3 75 4.4 Аналіз експресії мембранних рецепторів Fas/CD95 76

2. Характеристика структурних елементів, необхідних для розташування PRPF40B 154 3. PRPF40B взаємодіє зі сплайсеосомними компонентами SF1 та U2AF 65 156 4. PRPF40B модулює альтернативне сплайсинг 157 5. PRPF40B бере участь у процесі апоптозу 159 6. PRPF40B диференційовано виражається в нервовій тканині та функціях як активатор транскрипції 159 7. Призначення PRPF40B в AML 162 8. Подібності та відмінності між PRPF40A та PRPF40B 164 9. PRPF40B як з’єднувач процесів транскрипції та сплайсингу 165 VIII. БІБЛІОГРАФІЯ 169

Абревіатури Реверс зворотних відносних світлових одиниць RNAPII РНК-полімераза II Мотив розпізнавання РНК RN, мотив розпізнавання РНК s Друга стандартна помилка SEM середнього значення Ser2 серин 2 Ser5 серин 5 SF1 Фактор сплайсингу 1 SMA спинна м'язова атрофія, спинальна м'язова атрофія snornps малий ядерний рибонуклеопротеїн, малі ядерні рибонуклеопротеїни SNP однонуклеотидний поліморфізм SRE сплайсинг регуляторних елементів, сплайсинг регуляторних елементів TCERG1 Регулятор подовження транскрипції 1 Th4 треонін 4 TIA-1 Т-клітинний внутрішньоклітинний антиген-1 TNFR рецептор фактора некрозу пухлини, рецептор фактора некрозу пухлини TSS місце початку транскрипції TSS snrnp багатий уридином малий ядерний рибонуклеопротеїн U2AF U2 snrnp допоміжний фактор URE6 багатий на уридин екзонічний 6 елемент URI6 багатий на уридин інтронічний 6 елемент WB вестерн-блот WT дикий тип/дикий XIAP X-пов'язаний інгібітор апоптозу YBX3 Y-зв'язуючий білок 3 5

Вступ Рисунок I-2. Реакція складання і сплайсингу солей. Принципова схема утворення кожного комплексу (E, A, B, C) на етапах складання сплайсосоми. Представлені субодиниці snrnps U1, U2, U4, U5 та U6; а також коефіцієнти сплайсингу SF1 та U2AF. 3 SS, площа зрощення 3 (GA); 5 SS, площа зрощення 5 (GU); BPS, сайт пункту відділення (A); Py, поліпіримідиновий тракт; ЕД, визначення екзона. 2.2 Визначення екзону Набір факторів по обидві сторони інтрону під час первинного складання сплайсосоми не відбувається самостійно, але між ними існує зв'язок, що полегшує взаємне розпізнавання 5 SS та 3 SS місць. Однак великий розмір інтронів у порівнянні з довжиною екзонів, змушує цей зв'язок відбуватися через взаємодії, опосередковані вздовж екзона в процесі, відомому як визначення екзону (Berget, 1995). Далі, визначення інтрону відбувається за допомогою взаємодій, встановлених уздовж інтрону, що дозволяє наблизитися до субодиниць U1 та U2 snrnps сплайсосоми і, отже, до 3 SS та 5 SS сайтів, що створює функціональний комплекс (De Conti, Baralle, and Buratti, 2013). 16

Вступ Рисунок I-9. Схематичне зображення шляхів апоптозу. Зовнішній шлях активується позаклітинними подразниками і ініціюється зв'язуванням ліганду (FasL/TNF/TRAIL) із його позаклітинним мембранним рецептором (Fas/TNFR/TRAIL) та активацією каспаз. Внутрішній шлях активується внутрішньоклітинними сигналами, які реорганізують мітохондріальну мембрану, дозволяючи вихід цитохрому с у цитоплазму, що активує шлях каспази. Ці каспази можуть інгібуватися молекулами IAF, які, в свою чергу, регулюються такими факторами, як Smac/DIABLO, коли вони виходять з мітохондрій у цитоплазму. Обидва шляхи з'єднані протеолітичним розщепленням Bid. 7. АПОПТОЗ І СПЛИНГ Багато білків, що беруть участь в процесі апоптозу, регулюються шляхом альтернативного сплайсингу, утворюючи ізоформи, які мають протилежні функції, як це відбувається з геном Bcl-x та Fas. Для інтересу цієї докторської дисертації нижче будуть описані деякі аспекти регулювання альтернативного сплайсингу Fas. 48

Завдання Цілями даної докторської дисертації є: 1. Біохімічна характеристика PRPF40B a. Дослідження розташування PRPF40B b. Загальний аналіз структурних елементів, необхідних для його розподілу та функціонування. c. Визначення важливих взаємодій для функціональності PRPF40B. 2. Функціональна характеристика PRPF40B a. Визначте роль PRPF40B в альтернативному процесі зрощування. b. Дослідження участі PRPF40B у транскрипції c. Загальне дослідження функції PRPF40B в транскриптомі людини. 59

Матеріали і методи

Матеріали та методи екзони 5 і 7, включаючи проапоптотичні та антиапоптотичні ізоформи гена Fas. Ампліфіковані ПЛР-продукти розщеплювали на 3,5% агарозних гелях. Інтенсивність смуг визначали кількісно за допомогою програми Quantity One v4.6.5 (Bio-Rad). Експерименти проводились у трьох примірниках. Кількісне визначення гена Fas методом ПЛР у режимі реального часу проводили за допомогою iq SYBR Green Supermix (Bio-Rad) в термоциклерній станції крижаного цикла (Bio-Rad) з олігонуклеотидами FE6/FE7 (Tm 53,5 ° C), які вони посилюють область між екзонами 6 і 7 гена Fas, включеного в про-апоптотичну ізоформу. Як внутрішній контроль для кожного експерименту вимірювали рівні гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH), використовуючи олігонуклеотиди GAPDH-F/GAPDH-R. Експерименти проводились щонайменше п’ять разів. Значення представлені як (E Fas) CT (Fas)/(E GAPDH) CT (GAPDH), де E представляє ефективність ПЛР та CT: КТ контрольна проблема зразка-ct. Для статистичного аналізу було використано програмне забезпечення Prism 5.0 (GraphPad). Для порівняння середніх значень між зразками застосовували тест t-студента. Значення P представлені на графіках зірочками (*, P