старіння

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Екзогенний цАМФ покращує фенотип, пов'язаний зі старінням у літніх мишей
  • cAMP імітує ефекти обмеження калорій, збільшуючи рівень сиртуїну
  • Лікування CAMP покращує метаболізм жиру для зменшення імітації калорій
  • cAMP поширює сиртуїн, щоб запобігти окислювальному пошкодженню та старінню клітин
  • cAMP безпосередньо пов'язує SIRT1 та SIRT3
  • обговорення
  • Експериментальні процедури
  • Тварини та дієти
  • Культура клітин та лікування
  • Тести поведінки
  • Вимірювання вмісту карбонілу 8
  • Вимірювання нуклеотидів
  • Біохімічні вимірювання
  • Спостереження за гістохімічними зрізами
  • Аналіз білка
  • Поверхневий плазмовий резонанс
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

реферат

Циклічний аденозинмонофосфат (цАМФ) відіграє важливу роль у багатьох біологічних процесах як другий вісник, і, як повідомляється, лікування цАМФ продовжує життя дикого типу Drosophila melanogaster. Наше дослідження показало, що екзогенний цАМФ покращує фенотипи, пов’язані зі старінням, за рахунок підвищення рівня сиртуїнів, що перешкоджає метаболічним порушенням імітувати ефект калорій. Експерименти in vitro показали, що цАМФ зв’язується безпосередньо з SIRT1 та SIRT3 і згодом підвищує їх активність. Ці результати свідчать про те, що цАМФ уповільнює процес старіння і є гарним кандидатом для імітації обмеження калорій. Наше дослідження пропонує перспективну терапевтичну стратегію для захворювань, пов'язаних зі старінням, спричинених порушенням обміну речовин.

Обмеження калорій є ефективним втручанням для продовження як середнього, так і максимального життя 1. Однак омолоджуючий ефект споживання калорій вимагає зменшення споживання калорій приблизно на 30-40%, що для більшості людей є нестерпним. Багато дослідників намагалися знайти препарат, що імітує обмеження калорій, що має омолоджуючий ефект, не зменшуючи споживання енергії, наприклад, ресвератрол 2. Недавнє дослідження повідомило, що ресвератрол має омолоджуючу дію, пригнічуючи гідроліз цАМФ. Роліпрам, який спеціально інгібує гідроліз цАМФ, мав подібні ефекти до ресвератролу 3, вказуючи на потенціал цАМФ як міметика, обмеженого в калоріях. Інше дослідження показало, що тривалість життя дикого типу Drosophila melanogaster після лікування cAMP 4 була значно збільшена, припускаючи, що cAMP може відігравати ключову роль у затримці процесу старіння організмів.

SIRT1 був запропонований як антивіковий білок, і його активація призводить до позитивної користі для здоров’я кількох організмів 5. Повідомлялося, що відсутність прив’язки CAMP до адаптивних елементів (CREB) зменшує експресію SIRT1; CREB безпосередньо регулює транскрипцію Sirt1 в клітинах нейронів, зв'язуючись з хроматином Sirt1 6. Нещодавнє дослідження показало, що цАМФ активує кальмодулінкіназу кіназу II (CaMKKII) для підвищення рівня фосфорилювання AMPK, сприяючи тим самим продукуванню NAD + та активації SIRT1. Інше дослідження показало, що активація сигнального шляху cAMP-PKA призвела до швидкого фосфорилювання SIRT1 без зміни рівня NAD + 7. Ці результати висвітлили взаємозв'язок між цАМФ та SIRT1 у різних шляхах та припустили, що цАМФ може бути специфічним активатором SIRT1 та імітувати антивіковий ефект обмеження калорій.

SIRT3, як гомологічна деацетилаза SIRT1, знаходиться переважно в мітохондріях, де він зменшує кількість активних форм кисню (АФК), відповідальних за індукцію старіння клітин 8, 9. Крім того, існує незалежна система для регулювання виробництва та деградації цАМФ в мітохондріях для контролю генерації АФК 10, 11, але чи може цАМФ регулювати SIRT3 для зменшення окисного стресу, не повідомляється.

cAMP виконує різноманітні метаболічні процеси, пов'язані з метаболізмом гормонів, як другий вісник, і реакція cAMP на багато гормонів зменшується зі старінням 12, що припускає, що cAMP повинен відігравати важливу роль у регулюванні процесу старіння. Наше дослідження показало, що введення екзогенного цАМФ (дібутирилциклічний аденозин, db-цАМФ) підвищував рівень білка сиртуїну, щоб імітувати антивікові ефекти обмеження калорій, включаючи профілактику метаболічних порушень та поліпшення вікових фенотипів. Результати показали, що cAMP можна безпосередньо поєднувати з SIRT1/SIRT3, що свідчить про те, що cAMP має омолоджуючий ефект і є гарним кандидатом для міметиків з обмеженим вмістом калорій.

результат

Екзогенний цАМФ покращує фенотип, пов'язаний зі старінням у літніх мишей

Лікування CAMP покращує метаболізм жиру для зменшення імітації калорій

Щоб продемонструвати роль цАМФ у зменшенні калорій, ми годували мишей дієтою з високим вмістом жиру (60% енергії з жиру), що містить різні дози цАМФ або ресвератролу як позитивний контроль. Результати показали, що маса тіла мишей, оброблених цАМФ, продемонструвала дозозалежне зниження порівняно з необробленими мишами, які харчувалися дієтою з високим вмістом жиру (рис. 2А), без істотних змін у споживанні їжі (рис. 2Б). Дієта з високим вмістом жиру призвела до скоординованого функціонального зниження, спричиненого надмірною вагою; Лікування CAMP покращило рухову координацію у мишей з високим вмістом жиру (рис. 2C). Ми проаналізували епідидимальну жирову тканину мишей і виявили, що лікування цАМФ викликало дозозалежне зменшення розміру жирової тканини (рис. 2D). Результати біопсії показали, що дієта з високим вмістом жиру призвела до збільшення розміру адипоцитів у печінці та жировій тканині черевної порожнини миші; після лікування цАМФ розмір адипоцитів мав тенденцію до норми (рис. 2E, F). Рівні тригліцеридів та загального холестерину були підвищені в групі з високим вмістом жиру порівняно з групою, яка не отримувала лікування, а група, яка отримувала цАМФ, мала нижчий рівень обох, що припускає, що цАМФ може покращити метаболічні порушення (рис. 2G, H).

cAMP поширює сиртуїн, щоб запобігти окислювальному пошкодженню та старінню клітин

Зниження клітинної проліферації та посилення окисного стресу - дві важливі причини старіння клітин. Щоб вивчити механізм, що лежить в основі омолоджуючого ефекту цАМФ, ми дослідили зміни клітинного циклу з або без лікування цАМФ порівняно з Роліпрамом як позитивним контролем. Результати показали, що частка клітин S-фази демонструє тенденцію до зростання, але не досягає статистичної значущості, що свідчить про те, що механізм омолоджуючого цАМФ не залежав від посиленої проліферації клітин (рис. 3А).

Щоб підтвердити активуючий ефект цАМФ на сиртуїн, ми виміряли внутрішньоклітинний рівень цАМФ і результати диференціації в клітинній лінії С2С12 (рис. 3F, G), оскільки обмеження глюкози пригнічує диференціювання скелетних міобластів, активуючи SIRT122. Результати показали, що лікування цАМФ інгібує диференціювання клітин С2С12, припускаючи, що цАМФ підвищує активність SIRT1. На основі результатів наших експериментів на тваринах ми припустили, що антивіковий ефект цАМФ може бути досягнутий за рахунок зменшення окисного стресу, тому ми використовували пероксид водню (генерований АФК) для індукування старіння клітин. Результати асоційованої із старінням β-галактозидази (SA-β-gal) показали, що лікування цАМФ може запобігти індуковане АФК старіння клітин (рис. 3Н), припускаючи, що цАМФ зменшує окислювальний стрес. Результати також показали, що лікування db-cAMP втратило свою функцію, зменшуючи кількість позитивних фарбувальних клітин за допомогою лікування EX-527 (інгібітор сиртуїну), припускаючи, що здатність окисного стресу cAMP залежала від сиртуїну (рис. S). Ці результати свідчать про те, що антиоксидантний ефект цАМФ повинен залежати від збільшення активності як SIRT1, так і SIRT3.

cAMP безпосередньо пов'язує SIRT1 та SIRT3

Для подальшого дослідження механізму регуляторного впливу цАМФ на сиртуїн ми провели аналіз активності сиртуїну in vitro. Результати дозволяють припустити, що цАМФ може збільшувати активність SIRT1 та SIRT3 (рис. 4А, В). Крім того, метод поверхневого плазмонного резонансу (SPR) був використаний для виявлення взаємодії між цАМФ та сиртуїном. Результати показали, що цАМФ може зв'язуватися безпосередньо з SIRT1 (KD = 1,05) та SIRT3 (KD = 4,708) in vitro (рис. 4C-E). Оскільки і SIRT1, і SIRT3 є NAD + -залежними лізиндеацетилазами, а NAD + містить фрагмент AMP, структурна схожість cAMP з NAD + призвела до подібної здатності зв'язування. Автотранспортний аналіз був проведений, щоб пояснити механізм, що лежить в основі результату зв'язування цАМФ з SIRT1, і було показано, що сайти зв'язування цАМФ подібні до NAD +, коли пов'язані з білком SIRT1 (рис. 4F, G). Наша робота могла б стати відправною точкою для вивчення основного механізму регуляторного впливу цАМФ на сиртуїн (рис. 5).

( A ) Аналіз активності SIRT1. ( B ) Аналіз активності SIRT3. ( C - E ) Поверхневий плазмоновий резонанс, що вимірює зв'язування cAMP або db-cAMP з білками SIRT1 або SIRT3. Білки SIRT1 або SIRT3 були іммобілізовані на сенсорному чіпі CM5. Аналізи зв'язування проводили з використанням діапазону концентрацій cAMP або db-cAMP (15, 6-500 мкМ). ( F, G ) Механічна діаграма взаємодії між cAMP та SIRT1, отримана методом док-аналізу. Перший графік показує взаємодію між NAD та SIRT1 порівняно з другим графіком, який показує взаємодію між cAMP та SIRT1. Всі статистичні аналізи проводили з використанням одностороннього ANOVA. # p ## p ### p

Повнорозмірне зображення

обговорення

Наше дослідження показує, що дієтичні добавки цАМФ можуть підвищити регуляцію рівня білка сиртуїну, тим самим затримуючи початок вікових фенотипів, запобігаючи метаболічним порушенням. Ми показали, що цАМФ може зв'язуватися безпосередньо як з SIRT1, так і з SIRT3 in vitro, тим самим посилюючи активність SIRT1 і SIRT3 та імітуючи ефекти обмеження калорій. Ці результати свідчать про те, що цАМФ відіграє важливу роль у процесі старіння та має перспективний потенціал як міметик з обмеженим вмістом калорій для профілактики захворювань, пов’язаних зі старінням.

З часу відкриття cAMP як другого месенджера, який призвів до Нобелівської премії дослідника в 1971 році, дослідження зосереджувались на cAMP. На сьогодні, однак, цАМФ не став кандидатом на імітацію обмеження калорій, щоб уповільнити процес старіння. Дослідження показали, що голодування підвищує рівень цАМФ в результаті високого рівня глюкагону або низького рівня інсуліну/IGF-1, сигналізуючи 15, 23, припускаючи, що цАМФ може відігравати важливу роль у обмеженні калорій. Однак до нашого дослідження екзогенний цАМФ не повідомлявся як кандидат для імітації обмеження калорій. Наша робота пропонує докази того, що обмеження калорій підвищує рівень ендогенного цАМФ у багатьох органах для поліпшення фенотипів, пов’язаних зі старінням. Крім того, екзогенний цАМФ може імітувати антивіковий ефект обмеження калорій, включаючи підвищення регуляції SIRT1 та SIRT3, які є ключовими білками в обміні речовин та старінні.

Фізіологічна внутрішньоклітинна концентрація цАМФ становить 0,1 - 1 мкМ, але у випадку гормонів або стресу концентрація цАМФ може зрости більш ніж у сто разів (приблизно 100 мкМ). Під час оцінки активності SIRT1 та SIRT3 ми використовували 100 мкМ цАМФ та db-цАМФ для імітації концентрацій у фізіологічному діапазоні. Оскільки лише частина доповненого цАМФ могла стабільно потрапляти в клітини, ми припускаємо, що ці концентрації можуть мати подібний ефект, як м’які стресові умови, тобто обмеження калорій.

Нещодавно повідомлялося, що ресвератрол є інгібітором фосфодіестерази (PDE4), який конкурентно зв’язується з PDE4 та інгібує деградацію cAMP 3. Ми припустили, що цАМФ може зв'язуватися з SIRT1, а результати SPR підтвердили нашу гіпотезу та продемонстрували, що цАМФ та SIRT1 мають пряму взаємодію in vitro. Що ще цікавіше, cAMP також має пряму взаємодію з SIRT3, який регулює вироблення АФК в мітохондріях і уповільнює процес старіння. І SIRT1, і SIRT3 є NAD + -залежними лізиндеацетилазами. NAD + містить фрагмент AMP, тому cAMP безпосередньо взаємодіє з сімейством білків Сіртуїн. Наша робота представила докази того, що цАМФ може бути субстратним аналогом сиртуїну в умовах, обмежених калоріями.

Результати автоматичного стикування показали, що cAMP взаємодіяв із кишенею для зв'язування NAD + SIRT1, але не блокував каталітичну ділянку. Реакція сиртуїну та НАД + призвела до гідролізу НАД + на дві частини, НАМ та 2'-О-ацетил-АДФ-рибозу. На основі аналізу молекулярної структури cAMP і NAD + ми могли спостерігати, що коли cAMP зв’язується з SIRT1, зайнята лише половина зв’язуючого мішка, а каталітична сторона доступна для реакції між SIRT1 і NAD +. У цьому випадку NAD + буде взаємодіяти з каталітичним центром, що призведе до більш високого ризику гідролізу NAD +. Ми припустили, що зв'язування цАМФ із сиртуїном знижує стабільність NAD +, що покращує ефективність реакції між NAD + та сиртуїном.

Ми висунули гіпотезу, що зв'язування цАМФ та SIRT1 захищає каталітичну ділянку, яка була кишкою зв'язування Сіртуїну та НАД +. Таким чином, cAMP може пост-транскрипційно підвищити рівень білка SIRT1, як ми вже обговорювали. Ми припускаємо, що вплив цАМФ на підвищення рівня білків SIRT1 та SIRT3 базувався на підвищенні їх білкової стабільності завдяки зв'язуванню, що може обмежити деградацію білка.

Наша робота показала, що cAMP є хорошим кандидатом для імітації обмеження калорій. Як внутрішньоклітинний другий месенджер, цАМФ важливий у багатьох біологічних процесах. Процес старіння також складний і не може бути пояснений єдиним сигнальним шляхом. Ми вважаємо, що омолоджуючий ефект cAMP може залежати від мережі передачі сигналу, яка включає більше однієї мішені, що означає, що cAMP націлений на декілька сигнальних каскадів при регулюванні процесу старіння.

Експериментальні процедури

Тварини та дієти

Молодих (3-місячних) чоловічих мишей BALB/c купували у лабораторіях Vital River та обробляли їх згідно з інструкціями та схваленням Комітету з етики інституцій Китаю. Більш детальна інформація подана у додатковому матеріалі.

Культура клітин та лікування

Клітинні лінії C2C12 та 3T3-L1 культивували в DMEM (Thermo Scientific) з додаванням 10% FBS у 5% CO 2. Ex-527, з'єднання C, STO609 (Sigma) та H89 (технологія клітинної сигналізації) додавали за 1 годину до введення циклічного AMP, db-cAMP та Rolipram (Enzo Life Sciences). Потім клітини інкубували ще 1 годину до збору врожаю. Більш детальна інформація подана у додатковому матеріалі.

Тести поведінки

Для кожної групи вимірювали місцеву рухову активність та час, що минув з моменту прискорення обертового стрижня (Китайська академія медичних наук), щоб перевірити координацію та рівновагу мотора. Водний лабіринт Морріса та затримка падіння від струнних випробувань проводились з використанням обладнання Центру науки про життя при Університеті Цінхуа.

Вимірювання вмісту карбонілу 8

Кількісні карбоніли білка визначали за допомогою 2,4-динітрофенілгідразину (DNPH). Коротко, 1 мл 0,5 мг білка обробляли 200 мл 10 мМ DNPH (розчиненого у 2М HCl) протягом 1 години, а потім осаджували 10% трихлороцтовою кислотою. Гранули промивали тричі 1: 1 (об/об) етанол: етилацетат і розчиняли в 0,5 мл 0,2% SDS, 20 мМ Tris-Cl, рН 6, 8. Потім визначали концентрацію білка в кінцевому розчині за допомогою набору BCA (Thermo Scientific) вимірювали поглинання при 360 нм для розрахунку вмісту карбонілу. В якості заготовок використовували зразки білка, оброблені HCl, але не DNPH.

Вимірювання нуклеотидів

Вимірювання цАМФ проводили згідно з інструкціями виробника, використовуючи набір для аналізу Glo-cAMP (Promega). Більш детальна інформація подана у додатковому матеріалі.

Біохімічні вимірювання

Вимірювання загального холестерину, тригліцеридів та МДА проводили згідно з інструкціями виробника за допомогою набору для кількісного визначення (Blue Gene). Фарбування SA-ß-gal проводили відповідно до інструкцій виробника (Sigma).

Спостереження за гістохімічними зрізами

Зрізи печінки та жирової тканини фарбували гематоксиліном та еозином; шкірний колаген фарбували трихромом Массона. Спостереження проводили за допомогою світлового мікроскопа (Leica) і сканували зі збільшенням 40 разів.

Аналіз білка

Зразки вестерн-блот наносили на 10% SDS-поліакриламідні гелі і переносили на мембрани PVDF. Використовували такі антитіла: SIRT1, SIRT3 NF-κB та PPARγ (технологія клітинної сигналізації) та CaMKKII, PKAc, SIRT6 (Абгент) та PEPCK та актин (Санта-Крус).

Поверхневий плазмовий резонанс

Очищені білки SIRT1 (Abcam, чистота = 95%) або SIRT3 (R&D, чистота = 95%) були іммобілізовані на сенсорному чіпі CM5 (T200 Biacore, GE). Результати сортування та іммобілізації рН наведені в додатковій інформації (Рисунок S3-4).

Статистичний аналіз

Порівняння між групами проводили за допомогою односторонньої ANOVA. Відмінності вважали статистично значущими для p