Рекомендувати документи

vitro

Екран QUANTA LiteTM h-tTG/DGP

Для діагностики in vitro складність CLIA: Висока

Екран QUANTA Lite TM h-tTG/DGP - це імуноферментний аналіз (ІФА) для напівкількісного виявлення антитіл IgA та IgG проти синтетичних дезамідованих пептидів, отриманих гліадином (DGP), та проти трансглутамінази людської тканини (htTG) у людини. сироватка. Наявність цих антитіл може використовуватися разом із клінічними результатами та іншими лабораторними дослідженнями для діагностики суфікса IgA та целіакії з дефіцитом IgA (чутливість до глютену).

Принцип методу Очищені синтетичні дезамідовані пептиди гліадину (DGP або гліадин II) зв'язуються з клітинами полістирольної мікропланшетної пластини в умовах, що зберігають антиген у його нативній формі. Попередньо розведені контрольні зразки та розведені зразки сироватки пацієнта вводять у різні клітини, дозволяючи будь-якому пептиду гліадину та/або h-tTG IgA або IgG-антитілам зв'язуватися з іммобілізованим антигеном. Незв'язаний зразок промивають і до кожної клітини додають кон'югат IgG та IgA, мічений ферментами, проти людини. Друга інкубація дозволяє міченим ферментом анти-людським IgA та IgG зв’язуватися з будь-яким антитілом із зразка пацієнта, яке раніше зв’язувалося з клітиною. Після змивання всіх кандидатів незв'язаного ферменту з IgA та IgG проти людини, залишкова активність ферменту визначається додаванням хромогенного субстрату та вимірюванням інтенсивності отриманого кольору. Тест можна оцінити спектрофотометрично, вимірюючи інтенсивність кольору, що утворюється в клітинах, і порівнюючи його з контролем. 1

Реагенти 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Попередження 1. 2.

Заходи безпеки 1. 2. 3. 4.

може призвести до неприпустимо низьких значень поглинання. Важливо суворо дотримуватися інструкцій щодо поводження з кон'югатом HRP, щоб запобігти таким проблемам. Неправильне очищення приладів та інструментів може хімічно забруднити кон'югат HRP. Залишки часто використовуваних лабораторних хімічних речовин, таких як формалін, відбілювач, спирт або миючі засоби, спричиняють деградацію кон'югату HRP з часом. Після використання хімічних миючих чи дезінфікуючих засобів обладнання та посуд слід ретельно промити.

Умови зберігання 1. 2. 3.

Зберігайте всі реактиви набору при температурі 2-8 ° C. Його не можна заморожувати. Реагенти стабільні протягом зазначеного терміну придатності при обробці та зберіганні відповідно до вказівок. Невикористані мікротрубки з антигенним покриттям слід зберігати з осушувачем у фольгованій упаковці та закрити при температурі 2-8 ° C. Розведений промивний буфер стабільний протягом 1 тижня при 2-8 ° C.

Збір зразків та обробка Ця процедура підходить для тестування зразків сироватки. Не рекомендується додавати азид або інші консерванти до досліджуваних зразків, оскільки вони можуть спотворити результати вимірювань. Не слід використовувати зразки, що містять мікробіологічно забруднені, термооброблені або видимі осади або тверді частинки. Уникайте використання високогемолізованих або ліпемічних зразків. Після збору сироватку необхідно відокремити від згустку. “Документ CLSI (NCCLS) H18-A3” рекомендує такі умови зберігання зразків: 1) Не зберігайте зразки при кімнатній температурі більше 8 годин. 2) Якщо тест неможливо провести протягом 8 годин, зберігайте зразки в холодильнику при температурі 2-8 ° C. 3) Якщо тест неможливо провести протягом 48 годин або зразки потрібно транспортувати, заморозьте та зберігайте зразки при -20 ° C або нижче. Заморожені зразки слід ретельно перемішати після розморожування та перед випробуванням

Виконання тесту Матеріали, що є в комплекті 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Мікротитраційна пластина ELISA h-tTG/DGP (12-1 х 8 клітин) з опорною рамкою 1,2 мл попередньо розведеного негативного контролю ІФА (негативний контроль ІФА) 1,2 мл попередньо розведеного ІФА h-tTG/DGP помірно позитивний контроль (h- tTG/DGP Екран ELISA низький позитивний) 1,2 мл попередньо розведеного h-tTG/DGP Екран ELISA високий позитивний (h-tTG/DGP екран ELISA високий позитивний) 50 мл HRP Зразок розріджувача 25 мл HRP концентрат для промивання концентрату), 40-кратна концентрація 10 мл HRP h- tTG/DGP IgG/IgA (HRP h-tTG/DGP IgG/IgA), (коза), IgG та IgA проти людини 10 мл TMB Хромоген 10 мл HRP Стоп-розчин 0,344 M сірчаної кислоти

Додаткові матеріали, що не входять до комплекту Мікропіпетки для вимірювань 5, 100, 200-300 та 500 mérl Одноразові наконечники мікропіпеток Пробірки для розведення зразків пацієнтів об'ємом 4 мл дистильованої або деіонізованої води 1 л посудина для зчитування пластин для мікропланшетів HRP Wash вимірювання OD при 450 нм (або 620 нм для вимірювання на двох довжинах хвилі)

Спосіб Перед початком: 1. 2.

Зачекайте, поки зразки та реактиви досягнуть кімнатної температури (20-26oC), і добре перемішайте. Розведіть HRP промивний концентрат 1:40, додавши вміст пляшки HRP промивного концентрату до 975 мл дистильованої або деіонізованої води. Якщо одночасно не використовується вся пластина, можна розбавити меншу кількість: для кожних 16 використовуваних клітин додайте 2,0 мл концентрату до 78 мл дистильованої або деіонізованої води. Розведений буфер стабільний протягом 1 тижня при зберіганні при 2-8 ° C. Зробіть розведення 1: 101 для кожної проби пацієнта наступним чином: додайте 5 мкл проби до 500 мкл розчинника зразка HRP. Розбавлені зразки слід використовувати протягом 8 годин. НЕ РОЗВІДАЙТЕ h-tTG/DGP екран ELISA Помірний позитивний контроль, h-tTG/DGP екран ELISA Високий позитивний контроль та ELISA негативний контроль. Щоб визначити наявність або відсутність антитіл IgA та/або IgG h-tTG/DGP у будь-якій з одиниць, використовуйте дві клітини для вимірювання кожного з трьох контролів та одну або дві клітини для вимірювання кожної проби пацієнта. Рекомендується визначати повторювані зразки за зразками пацієнтів.

Проведення тесту 1.

Контроль якості 1. 2. 3.

Обчислення результатів Спочатку визначте середнє значення OD для кожного репліката. Потім реакційну здатність кожного зразка можна розрахувати шляхом ділення середньої OD зразка на середню OD зовнішнього аналізу h-tTG/DGP, помірно позитивного контролю. Помножте результат на кількість одиниць на h-tTG/DGP Екран ІФА Помірний позитивний ярлик контролю.

Зразок OD Значення зразка = —————————————————— x h-tTG/DGP Екран ІФА помірно позитивний (одиниці) h-tTG/DGP Екран ІФА помірно позитивний OD (одиниці) A існує нелінійна залежність між реакційною здатністю та кількістю антитіл у зразку. Хоча збільшення та зменшення концентрації антитіл у пацієнта відображається на пов'язаному з цим збільшенні та зменшенні реактивності, зміна не буде пропорційною (тобто подвоєння концентрації, але не подвоєння реактивності). Якщо потрібно більш точне визначення концентрації антитіл у пацієнта, слід перевірити серію розведення зразка пацієнта та розглянути останнє розведення, яке все ще є позитивним у зразку.

Інтерпретація результатів Кожна лабораторія повинна визначати свої власні контрольні діапазони, використовуючи методи, засоби контролю, пристрої, що використовуються в даний час, і способом, специфічним для досліджуваної групи пацієнтів, відповідно до своїх власних процедур. Класифікація вибірки може бути негативною або позитивною згідно з таблицею нижче. Негативний Позитив 1. 2. 3.

Позитивний результат свідчить про наявність пептиду гліадину та/або антитіл IgG та/або IgA h-tTG у зразку та підвищує ймовірність деяких чутливих до глютену ентеропатій, таких як целіакія. Негативний результат вказує на те, що у пацієнта немає пептиду гліадину та/або антитіл IgG або IgA h-tTG або що їх концентрація не досягає діагностичного порогу тесту. Рекомендується, щоб оцінка, видана лабораторією, включала таке твердження: «Наступні результати були отримані за допомогою екрану INOVA QUANTA LiteTM h-tTG/DGP. Значення пептиду гліадину та tTG IgG/IgA, отримані в результаті тестів інших виробників, можуть бути різними та не є взаємозамінними. Зазначену кількість антитіл не можна порівняти з титром кінцевої точки ".

Обмеження методу 1. 2. 3.

Очікувані значення Базовий діапазон 496 випадково відібраних, безсимптомних, здорових людей у ​​США тестували на антитіла h-tTG/DGP. З них 299 донорів мали вік від 14 до 78 років, 150 чоловіків та 149 жінок. Було 7 зразків (1,4%), що перевищували межу з 20 одиниць. 5 зразків були позитивними з наступними значеннями: 20,2, 22,1, 23,4, 29,2 та 36,5 одиниць. Інші дві позитивні проби становили 46,1 та 39,0 одиниць відповідно, ймовірно, це були справжні зразки целіакії, завдяки тому, що їх результати h-tTG IgA становили 57,2 та 72,4 одиниці відповідно. Стандартне відхилення лише негативних зразків становило 3,8 одиниць. Середнє значення втричі перевищувало стандартне відхилення під час відсікання 20 одиниць.

Конкретні експлуатаційні характеристики Порівняння із затвердженим продуктом

99 зразків з чотирьох еталонних лабораторій целіакії було протестовано на екрані QUANTA LiteTM Celiac DGP Screen, QUANTA LiteTM h-tTG IgA, QUANTA LiteTM h-tTG IgG та ELISA QUANTA LiteTM htTG/DGP Screen. Результати їх, а також результати 496 нормальної вибірки наведені на малюнку 5 нижче

Зразок вважався позитивним на основі використання прийнятого продукту, якщо він був визнаний позитивним для одного з трьох прийнятих продуктів (результат не міг бути позитивним на всіх трьох пристроях). Зразок вважався негативним на основі використання прийнятого продукту, якщо він дав негативний результат на всіх трьох пристроях. N = 595 Celiac DGP Screen та/або h-tTG Позитивний Негативний h-tTG/DGP Екран Позитивний 48 4 * Негативний 7 ** 536 Позитивний Відсоток відповідності: Негативний Відсоток відповідності: Загальний матч:

48/55 (87,3%), 95% довірчий інтервал: 94,5 до 94,7% 536/540 (99,3%), 95% довірчий інтервал: 94,5 до 97,4% 584/595 (98,2%), 95% довірчий інтервал: 96,7 до 99,1 %

* З 4 зразків, які були виявлені h-tTG/DGP Екран-позитивними, проте обидва набори h-tTG були негативними, 3 були отримані з нормального тесту. Четвертим пацієнтом був хворий на целіакію на безглютеновій дієті, 22,1 одиниці. ** З 7 зразків, для яких виявлено, що h-tTG/DGP є позитивними на екрані, але негативними для Celiac DGP або для набору h-tTG, 5 були отримані за допомогою звичайного тесту. Решта була хворим на целіакію на безглютеновій дієті зі значенням 21,5 одиниць за тестом h-tTG IgA. Інший зразок був родичем першого ступеня з 20,2 одиницями на тесті Celiac DGP Screen.

Клінічні випробування Клінічно визначені зразки, такі як неліковані пацієнти з целіакією (139 педіатричних пацієнтів), хворі на целіакію, хворі на целіакію з дефіцитом IgA, латентні целіакії, уперті на целіакію, хворі на целіакію на безглютеновій дієті, хворі на целіакію першого ступеня, зразки хворих на целіакію від пацієнтів, які не страждають на целіакію, проходили тестування вдома та в зовнішніх клінічних випробуваннях на екрані QUANTA LiteTM h-tTG/DGP. Підсумок результатів клінічно визначених зразків, а також зразків у нормальних межах, згаданих вище, наведено нижче. Група пацієнтів # h-tTG/DGP позитивний% Нелікована целіакія (дитина) 185 (139) 183 (139) 99% (100%) Целіакія, дефіцит IgA 5 5 100% Целіакія, прихована 11 10 * 91% Целіакія, впертий 9 8 * * 89% на целіакії, безглютеновій дієті 120 34 28% родичі першого ступеня 18 2 11% Контроль пацієнтів 76 8 10,5% Нормально 914 20 *** 2,2% * З 11 прихованих хворих на целіакію, 8 були tTG IgA-позитивні та 9 EMA-позитивні ** З 9 пацієнтів із стійкою целіакією, жоден не був EMA-позитивним, і лише 2 (22%) були tTG-позитивними. З 20 позитивних, які дали позитивний результат на індивідуальний h-tTG та DGP ELISA, 2 були tTG позитивними для тесту RIA на рідку фазу. Ефективність h-tTG/DGP Screen ELISA у діагностиці целіакії

Позитивний Нелікована целіакія, дитина, дефіцит IgA, латентний або впертий

Діагноз * Негативний (родичі першого ступеня, контроль пацієнтів та здоровий контроль) 30978 1008

QUANTA Positive 207 LITE ™ Negative 3 h-tTG/DGP Total 210 Screen * Виключає хворих на целіакію на 120 дієтах без глютену.

Чутливість: 98,6% (207/210), 95% довірчий інтервал: 94,5-99,7% Специфічність: 97,0% (978/1008), 95% довірчий інтервал (ДІ): 94,5-98,0% об'єднання результатів від усіх хворих на целіакію (крім тих, хто вже перебуває на безглютеновій дієті). Із загальної кількості 210 целіакії 207 (тобто 98,6%) були позитивними. Специфічність - Специфічність була розрахована на основі об'єднання результатів 914 нормальних, 76 контрольних пацієнтів та 18 родичів першого ступеня. Ця група містила загалом 1008 зразків. З них 30 зразків були позитивними із специфічністю 97,0%.

Перехресна реактивність Для оцінки очікуваних проблем з можливою перехресною реактивністю з іншими аутоантитілами, різні позитивні зразки аутоантитіл із високим титром тестували за допомогою екранного набору QUANTA Lite TM h-tTG/DGP. Всього було протестовано 83 зразки. Кілька зразків були високопозитивними контролями для інших наборів для тестування на антитіла INOVA QUANTA LiteTM. Зразки включають актин (4), хроматин (7), дсДНК (4), М2 (4), 6

MPO (5), Centromer (7), CCP3 (5), GBM (9), Ribo P (4), RF IgG (4), SS-B (4), RNP (4), Scl-70 (4), Jo-1 (4), Sm (4), SS-A (6) та TPO (4). Середнє значення 83 зразків становило 4,51 одиниці. Усі зразки були негативними на екрані QUANTA LiteTM h-tTG/DGP. Середнє значення в 4,4 рази перевищувало стандартне відхилення під час відсікання 20 одиниць.

Внутрішньолабораторна точність

Ефективність внутрішнього аналізу екрану QUANTA Lite TM h-tTG/DGP оцінювали шляхом повторного тестування 12 зразків, по 5 разів кожен. Цей тест був проведений одним оператором у діагностиці INOVA у комплекті для однієї дози. Результати наведені в таблиці нижче. QUANTA LiteTM h-tTG/DGP Екран ІФА Ефективність внутрішнього аналізу 1 2 3 4 5 6 7 8 9 середнє 113,3 62,9 41,3 35,7 22,1 21,6 18,7 19,0 7,9 SD 1,3 1,1 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 0,9 1,0 CV% 1,2 1,7 1,7 1,7 1,9 1,2 1, 2 4,5 12,4

У дослідженні змін між випробуваннями група з 12 зразків тестувалась у двох примірниках протягом 3 днів, двічі на день (один раз вранці та один раз вдень). Цей тест був проведений одним оператором в діагностиці INOVA у комплекті для однієї дози. Результати дослідження зведені в таблиці нижче. QUANTA LiteTM h-tTG/DGP Екран ІФА Ефективність аналізу в середньому ABCDEFGHIJKL середнє 66,6 117,1 46,4 22,4 36,8 22,9 16,1 17,1 7,2 6,6 6,6 9, 7 SD 2,1 3,6 2,4 1,2 3,3 1,1 1,1 0,3 0,3 0,7 1,4 1,8 CV% 3,2 3,2 5,2 5 .3 9,0 9,5 6,9 8,7 4,4 11,2 21,3 18,8 Різниця в дозі Дослідження різниці доз проводили в діагностиці INOVA, використовуючи три набори для лікування та три різні набори доз у три різні дні. Результати дослідження зведені в таблиці нижче. Зразок Сильний позитивний контроль Позитивний 1 Позитивний 2 Позитивний 3 Позитивний 4 Позитивний 5 Позитивний 6 Позитивний 7 Позитивний 8 Пустий тест Негативний контроль Негативний 1 Негативний 2 Негативний 3 Негативний 4

Порції 1 88,23 53,22 104,68 44,16 27,31 30,63 22,23 40,39 114,13 1,66 1,71 6,64 6,44 8,55 8,55

Порції 2 77,39 57,92 118,56 43,85 21,24 36,85 23,23 47,32 121,18 1,66 1,54 5,64 6,61 8,94 11,90

Доза 3 Середнє значення Std Dev CV% 98,90 88,17 10,76 12,20 58,94 56,69 3,05 5,38 110,69 111,31 6,96 6,25 44,83 44,28 0,50 1,13 29,48 26,01 4,27 16,42 37,25 34,91 3,71 10,63 21,74 22,40 0,76 3,39 46,74 44,82 3,84 8,58 1,93 3,46 3,66 8,98 1,93 3,41 3,69 9,16 3,76 1,93 3,41 3,76 1,93 3,16 3,41 3,69 3,41 3,69 3,41 3,69 3,41 3,69 9,16 3,41 3,66 3,41 3,66 3,63 9,16 3,41 3,63 9,16 3,41 3,63 3,41 3,46 3,63 8,68 1,96 1,74 0,21 12,17 7,43 6,57 0,90 13, 65 8,63 7,23 1,22 16,86 9,19 8,89 0,32 3,63 12,45 10,97 2,11 19,25

Список літератури 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.