КАЛМАН КЕРПЕЛІ ДОКТОРАЛЬНА ШКОЛА Керівники: проф. Д-р Іштван Почі Доктор Угорської академії наук проф. Д-р Янош Надь, доктор Угорської академії наук KLUYVEROMYCES MARXIANUS

калмана

(Доктор філософії) Штами дріжджів K. marxianus РОЗВИТОК ВИРОБНИЦТВА БІОЕТАНОЛУ Для дисертації на здобуття докторської ступеня Написано галуззю сільськогосподарських досліджень: Єва Ліс, біолог/біотехнолог, підготовлена ​​в рамках вищої школи ім. Наукові керівники: проф. Д-р Іштван Почі та проф. Д-р Янош Надь. Комітет з докторантури: Ім'я голови: проф. Д-р Ботонд Сінорос-Сабо Члени: д-р Дьєрдь Денес Біштрей д-р Тамаш Ратоні Дата проведення докторського іспиту: 15 червня, 2011 р. 11 ранку. Можна. ступінь доктора наук Кандидат технічних наук Рецензенти дисертації: Ім'я. Можна. ступінь. Журі: Ім'я знає. ступінь Підпис Президент. Учасники. Секретар. Дата захисту дисертації: 2011 2

4.2.1. Визначення вмісту трегалози. 57 4.2.2. Визначення вмісту GSH та GSSG. 59 4.2.3. Тести на стресостійкість. 60 4.2.4. Дослідження білків теплового стресу. 62 5. ВИСНОВКИ, ПРОПОЗИЦІЇ. 64 6. НОВІ І НОВАЦІЙНІ НАУКОВІ РЕЗУЛЬТАТИ. 66 7. РЕЗЮМЕ (угорською мовою). 67 8. РЕЗЮМЕ (англійською мовою). 70 9. СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ. 72 10. ПУБЛІКАЦІЇ З ТЕМИ ДИСЕРТАЦІЇ. 87 11. ПОДЯКИ. 89 12. ЗАЯВИ. 90 5

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ CBS NCYC YPD YM OD HP HPTLC ku DCM GSH GSSG GR EDTA DTNB NADPH BSA PMSF SDS SDS-PAGE TRIS TEMED APS RSM Centraalbureau voor Schimmelcultures Національна колекція дріжджової культури Дріжджовий екстракт, пептон, декстроза, декстроза, декстроза, декстроза, декстроза екстракт дріжджів, солод) оптична щільність Hewlett Packard тонкого шару високого тиску Хроматографія кіло Одиниця вмісту сухої речовини (суха клітинна маса) знижений глутатіон окислений глутатіон глутатіон редуктаза етилендіамінтетраоцтова кислота 5,5-дитио-біс (2-нітробензойна кислота) нікотинамід аденін динуклеотид кальцію сироватковий альбумін α толуїлсульфонілфторид (фенілметилсульфонілфторид) додецилсульфат натрію SDS-поліакриламід гель електрофорез трис (гідроксиметил) амінометан, N-тетраметилетилендіамід Пермульфат амонію Поверхня реакції Методологія 6

Нарешті, дослідження термотолерантного мутанта K. marxianus мікробними фізіологічними методами: - Визначення вмісту внутрішньоклітинної трегалози. - Визначення вмісту GSH, GSSG. - Виявлення білків теплового шоку. - Дослідження толерантності до етанолу, окисного та осмотичного стресу. 9

Ми виділяємо групу, засновану на сировині та технології, що використовуються для їх виробництва: біопаливо першого, другого та третього поколінь (рис. 1). Рисунок 1: Групування біопалива (за даними Nigam та Singh, 2011) Незважаючи на те, що біопаливо має ряд переваг, для країн все ще існує низка проблем з точки зору виробництва та торгівлі. Перш за все, повинні бути створені адекватні та економічно вигідні сховища сировини та транспортні мережі для сировини. Розробка відповідної технології виробництва також має важливе значення для ефективної роботи. Необхідно запровадити нові закони щодо норми змішування біопалива, субсидій та можливих податкових пільг. 2.1.1.1. Біопаливо першого покоління Біопаливо першого покоління виробляється із злаків та інших культур із різним вмістом цукру або крохмалю, таких як кукурудза (Nicolic et al., 2010; Mojovic et al., 2006), пшениця (Talebina et al., 2010) та рис (When-Hua C. 11

Малюнок 2: Технологія SHF (роздільний гідроліз та ферментація) (за Райтом, 1988). Рисунок 3: Технологія SSF (одночасне оцукрювання та бродіння) (за Райтом, 1988). 20

Рисунок 4: Філогенетичний взаємозв'язок та деякі характеристики Kluyveromyces marxianus та споріднених дріжджів. Джерело: Lane and Morrissey, 2010 та база даних колекції культур Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) (http://www.cbs.knaw.nl/). Традиційно види, що належать до цього роду, одноманітно вважалися гаплоїдними (Johannsen, 1980; Steensma та ін., 1998), але останні публікації, що містять молекулярні роботи, свідчать, що це не завжди так. Наприклад, публікація, опублікована Ribeiro et al. (2007), припускає, що широко використовуваний штам K. marxianus CBS 6566 є диплоїдним. Все це вказує на те, що гаплоїдні та диплоїдні форми K. marxianus також можуть бути присутніми в науково-дослідних та промислових технологічних процесах (Hong et al., 2007; Nonklang et al., 2009). 2.5.2. Біотехнологічне значення та застосовність K. marxianus Перш за все, важливо згадати, що більшість досліджень штамів K. marxianus не вважали своєю метою вивчення біохімії, метаболізму або фізіології штаму. Більшість доступних публікацій присвячені організму 25

Малюнок 5. Реакція на дріжджовий тепловий стрес (згідно Trott A. та Morano K.A., 2003) Трегалоза використовується переважно дріжджовою клітиною як джерело запасних вуглеводів, а також міститься у спорах як джерело вуглецю, яке легко використовувати. У логарифмічній фазі кількість трегалози в клітинах дуже мало, але під впливом теплового стресу вона зростає в геометричній прогресії (Thevelein and Hofmann, 1995). Трегалоза надає захисну дію на білки, блокуючи індуковану теплом агрегацію білка та інгібуючи зміни в структурі білків, з якими він зв'язується. Крім того, глутатіон (GSH, γ-глутамілцистеїнілгліцин) як антиоксидант, нейтралізуюча молекулу вільних радикалів також бере участь у захисті від теплового стресу. Завдяки швидкій і скоординованій роботі цих процесів клітина здатна пережити стрес, спричинений тепловим шоком. 28

3. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 3.1. Культура та підтримка Kluyveromyces marxianus CBS712 (NCYC 2791) та E1 мутантних штамів K. marxianus CBS712 було придбано у штаму NCYC (Національна колекція дріжджових культур). Мутант K. marxianus E1 був отриманий із штаму CBS712 на малюнку 3.2. як описано в цій главі. Штами вирощували на агарі YPD та YM при 30 С для щоденної практичної роботи. Склад середовища YPD: 1% дріжджового екстракту (BBLTM), 2% пептону (Difco), 2% глюкози, 2% агару. Склад середовища YM: 0,3% дріжджового екстракту (BBLTM), 0,3% солодового екстракту, 0,5% пептону (Difco), 1% глюкози, 2% агару. РН середовища як YPD, так і YM становить 5,5. Штами зберігали у фондовій колекції в середовищі YM з додаванням 20% гліцерину при -70 ° С. 3.2. Вироблення та ідентифікація термотолерантного мутанта K. marxianus E1 100 окремих колоній штаму K. marxianus CBS712 інокулювали з агаризованого середовища YPD у 5 мл середовища YPD та інкубували при 48 ° С з частотою струшування 3 Гц протягом 2 днів. Культури, що продемонстрували ріст, висівали у свіже середовище YPD та інкубували в тих самих умовах (48 С, 3 Гц) також протягом 2 днів. Це щеплення 29

3.11.5.2. SDS-PAGE Зразки білка піддавали термічній обробці відновлюючим буфером зразків (5 хв, водяна баня на 100 ° C) перед завантаженням на гель SDS. Склад відновлювального буфера зразка: 10% (мас./Об.) Гліцерину, 2% (мас./Об.) TRIS/HCl буфер (0,5 моль л -1, рН 6,8), 2,5% (мас./Об.) Розчину бромофенолового синього, 5% (мас./об.) меркаптоетанол. Для розділення білків я використовував 12,5% (мас./Об.) Поліакриламідного гелю (Laemmli, 1970) та Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США). Склад основного гелю (12,5%): 4,2 мл 30% (мас./Об.) Розчину акриламіду, 2,5 мл буфера TRIS/HCl (1,5 моль л -1, рН 8,8), 0,1 мл 10% (мас./Об.) ) Розчин SDS, 3,02 мл дистильованої води, 5 мкл TEMED, 50 мкл 10% (мас./Об.) APS. Компоненти гелю для збору (5%): 0,44 мл 30% (мас./Об.) Розчину акриламіду, 0,83 мл буфера TRIS/HCl (0,5 моль л -1, рН 6,8), 33 мкл 10% (мас./Об.) v) розчин SDS, 2,03 мл дистильованої води, 2 мкл TEMED, 16,7 мкл 10% (мас./об.) APS. 36

Склад буферного резервуару: 1,5% (мас./Об.) TRIS, 0,5% (мас./Об.) SDS, 7,2% (мас./Об.) Гліцину (ph 8,3). Для визначення молекулярної маси білка я використовував Page Ruler Protein Standards (MBI Fermentas, Німеччина). Коли зразок знаходився у збірному гелі, використовували напругу 200 В, а коли він вже був у основному гелі, напругу 200 В використовували для розділення білків у зразку. Після електрофорезу білкові смуги візуалізували за допомогою фарбування Coomassie Brillant Blue. 3.12. Статистичні методи 3.12.1 Загальні статистичні методи Для статистичного аналізу в кожному випадку визначали середнє значення 3-5 незалежних вимірювань та їх стандартні відхилення. Для вивчення значущості був використаний t-тест Стьюдента, де с