Предмети
Резюме
Морські губки - це древні, сидячі метазої, що живляться фільтром, і представляють важливу складову донних спільнот у всьому світі. Губки містять неабияке розмаїття бактерій, проте мало відомо про функціональні властивості таких бактеріальних симбіонтів. У цьому дослідженні ми представляємо геномну та функціональну характеристику некультивованої δ-протеобактерії, асоційованої з губкою Cymbastela koncentrica. Ми показуємо, що цей організм являє собою нову філогенетичну кладу, і ми припускаємо, що він живе спільно з ціанобактерією. Ми також надаємо огляд передбачуваних функціональних та екологічних властивостей цієї δ-протеобактерії та обговорюємо її складну взаємодію з навколишніми клітинами та навколишнім середовищем, включаючи особливості прикріплення клітин, транспортування поживних речовин та білково-білкової взаємодії.
Вступ
Матеріали і методи
Філогенетичний аналіз
Початкова таксономічна класифікація послідовності генів протеробактерій 16S рРНК була проведена з використанням алгоритму Байєса за класифікатором із заздалегідь визначеними параметрами в проекті Ribosomal Database Project (Wang et al., 2007; Cole et al., 2009). Найближчі сусідні послідовності (як для некультурних, так і для ізольованих представників) послідовності гена rS-протеобактеріальних 16S були вилучені з проекту Ribosomal Database Project 10 за допомогою функції seqmatch, а потім вирівняні за допомогою веб-вирівнювача SINA (Pruesse et al., 2007). Філогенетичне дерево було побудовано з використанням алгоритму максимальної вірогідності з повнорозмірними послідовностями генів 16S рРНК (> 1200 нт) у програмному пакеті ARB (Ludwig et al., 2004). Щоб уникнути використання сильно варіабельних областей для порівнянь, використовували позиційну маску позиційної мінливості (pos_var_Bacterias_94) та специфічну для користувача кінцеву маску, що призвело до порівняння 1178 нуклеотидів у конструкції дерева. Неосвічений евріархеот. (Genbank Accession: AB077227) був використаний як зовнішня група при побудові дерева.
Геномна та порівняльна геномна реконструкція.
Частковий геном протеобактеріальних видів був реконструйований шляхом об'єднання даних секвенування дробовиків від бактеріального співтовариства губки C. koncentrica (Thomas et al., 2010). Кластеризація риштування з послідовністю> 20 kb проводилась згідно модифікації стратегії, описаної Woyke et al. (2006) та Thomas et al. (2010) і більш докладно описаний у Додатковій інформації.
Локалізація δ-протеобактерій
Зразки морської губки C. koncentrica були зібрані в Ботані-Бей, недалеко від острова Голі, Сідней, Австралія (S 33.59.461; E 151.13.946) протягом серпня 2009 р. Після забору тканини C. концентрика промивали кальцієм та без магнію. морської води (25 г NaCl, 0,8 г KCl, 1 г Na2SO4, 0,04 г NaHCO3 на 1 л) і негайно переносять у 15% розчин сахарози. Зразки переносили назад у лабораторію на льоду протягом 1 години. Флуоресцентну гібридизацію in situ (FISH) проводили, як описано в Додатковій інформації, з підтвердженими зондами, націленими на бактерії загалом та конкретно на δ-протеобактерії.
Результати та обговорення
Нова актер-протеобактеріальна клада губкоасоційованих бактерій
Дерево максимальної вірогідності послідовності гена 16S рРНК δ-протеобактерії з C. koncentrica та споріднених організмів. Дерево було побудоване на 1178 нуклеотидах гена 16S рРНК. Неосвічений евріархеот. (AB077227) використовували як зовнішню групу для аналізу (не показано на дереві). Смужка шкали вказує на 0,1 зміни нуклеотидів (10%) на позицію нуклеотиду. U, неосвічений; Я, ізоляція.
Повнорозмірне зображення
Асоційована з губками група протепротеобактерій також відрізнялася від родів Desulfuromonas та Bacteriovorax, з рівнем дивергенції 24% та 30%, відповідно. Рід Desulfuromonas містить водні види, які, як відомо, ростуть анаеробно завдяки окисленню ацетату з одночасним відновленням елементарної сірки або Fe (III) (Pfennig and Biebl, 1976). Види бактеріовораксу паразитують на інших грамнегативних бактеріях і мають дуже рухливу, вільноживучу позаклітинну фазу, під час якої вони шукають нових господарів. Фенотипові характеристики цього роду ідентичні характеристикам Bdellovibrio, і Bacteriovorax нещодавно було перекласифіковано як окремий рід на основі філогенезу на основі гена 16S рРНК (Baer et al., 2000, 2004).
Філогенетичний аналіз, проведений тут, показав, що δ-протеобактерії C. koncentrica, можливо, представляють новий рід або сімейство і що члени цієї групи бактерій, які ще слід культивувати, пов'язані з губками.
Функціональне геномне порівняння губки протеобактерій із спорідненими бактеріями
Функціональне порівняння геному на основі категорій COG часткового геному δ-протеобактерії та геномів геному B. bacteriovorus HD100 ( до ) і D. ацетоксидани DSM684 ( b ). Вісь Y показує медіанне значення зі значним значенням відсікання -2 і 2.
Повнорозмірне зображення
Щоб зрозуміти, чи мають певні функції геному протеобактерії спільну еволюційну історію зі спорідненими геномами, ми класифікуємо всі його білки таксономічно за алгоритмом нижчого загального предка, реалізованому в MEGAN (Huson et al., 2007). Таксономічний аналіз 663 білків показав, що 249 можна віднести до B. bacteriovorus HD100, 4 - до D. acetoxidans DSM684, 185 не потрапив у базу даних непотрібних GenBank, а решту білків призначали на різних рівнях у бактеріях або просто клітинні організми (Додаткова таблиця S4). Ці результати показують, що геном проте-протеобактерії має більше збережених білків з геномом B. bacteriovorus HD100, ніж будь-який інший доступний геном.
Це показує, що, крім прикріплення та рухливості, процес біогенезу клітинної стінки також є еволюційно збереженою функцією губки протеобактерій та B. bacteriovorus .
Губка проте-бактерія демонструє клітинний спосіб життя
Подібність, виявлена в рухливості, прикріпленні та біогенезі клітинної стінки, порівняно з B. bacteriovorus, призвела нас до гіпотези, згідно з якою губка протеобактерій може також утворювати асоціацію (потенційно хижацьку за своєю природою) з іншими бактеріальними клітинами. Тому ми досліджували фізичне розташування ob-протеобактерії в губці шляхом флуоресцентної гібридизації in situ. За допомогою зонда для бактеріального домену (EUB338) ми вперше продемонстрували присутність великої кількості бактерій у губці C. koncentrica (рис. 3а). Зонд, спрямований проти послідовності 16S рРНК δ-протеобактерії, привів до виявлення дрібних клітин (довжиною 3 мкм) і лише зрідка виявлявся як вільно живуть клітини (малюнки 3b та c). Відносна частка δ-протеобактерій проти загальної мікробіоти оцінювалася в 6,4% ± 1,8% (див. Додаткову інформацію), що аналогічно 2,2% ± 0,8% послідовностей, виявлених у трьох бібліотеках ПЛР гена 16S рРНК, що належать до al δ - протеобактерія (Thomas et al., 2010). Розташування проте-протеобактерій часто було в кінці більших автофлуоресцентних клітин.
Повнорозмірне зображення
Аутофлуоресцентні клітини-господарі демонстрували зелену автофлюоресценцію при збудженні світлом 488 нм, що узгоджується з флуоресценцією цианобактерій, діатомових водоростей та динофлагелатів (Tang and Dobbs, 2007). Щоб визначити, чи були аутофлуоресцентні клітини еукаріотичними (тобто діатомовими водоростями або динофлагелетами) чи бактеріальними (тобто ціанобактеріями), ми провели додатковий аналіз FISH, використовуючи конструкцію гібридизації з двома зондами, з міченим Cy3 зондом, специфічним для проте-протеобактерії та флуоресцеїну ізотіоціанату -мічений бактеріально-специфічний зонд. На малюнку 3d показано, що аутофлуоресцентні клітини реагували на загальний бактеріальний зонд. Отже, на основі особливої автофлюоресценції та зв'язування зонда, специфічного для бактерій, ці клітини, ймовірно, є ціанобактеріями. Ця знахідка узгоджується із спостереженням, зробленим 30 років тому Уілкінсоном (1979), який за допомогою електронної мікроскопії знайшов частинки, подібні до бдельловібріо, в одноклітинних ціанобактеріях у мезоїлі двох коралових губок, Neofibularia irata та Jaspis stelifera. .
Очікувані функціональні властивості δ-протеобактеріальної губки
Для кращого розуміння функціональних властивостей нової протеобактерії ми провели ретельний ручний аналіз її часткового геному з урахуванням фізіологічних та екологічних функцій.
Ми ідентифікували субодиниці кінцевого ферменту в аеробному дихальному ланцюзі, цитохром С-оксидази, в частковому геномі (1108814258778_ORF0001). Отже, губка протеобактерій здатна рости аеробно; додатково відрізняючи його від суміжних суворо анаеробних видів Desulfuromonas.
Схематичне зображення ORF, що кодують білки AR та TRP, у ешафоті δ-протеобактерій 110814258323. ORF показані стрілками з відносними положеннями нуклеотидів.
Повнорозмірне зображення
Висновки
За допомогою незалежних від культури підходів ми виявили та охарактеризували нову протеобактерію, яка, можливо, представляє новий рід чи сім’ю. Наскільки нам відомо, цей асоційований з губками організм представляє лише третю групу протеобактерій, асоційованих з господарем. Вважається, що губка протеобактерії живе спільно з ціанобактеріями і, ймовірно, впливає на фізіологію свого фотосинтезуючого господаря. Це, у свою чергу, може мати наслідки для губки-господаря, яка часто містить фотосинтетичні симбіонти і, отже, отримує фотосинтетично фіксований вуглець (Venn et al., 2008). Функціональна геномна характеристика некультурних δ-протеобактерій, описана тут, також вказує на складні взаємодії з оточуючими клітинами та навколишнім середовищем. Це дослідження пропонує розуміння багаторівневої взаємодії між губкою, яка служить господарем ціанобактерії, яка, у свою чергу, є господарем проте-протеобактерії.