предметів

реферат

Малина (Rubus ideaus L.) - ніжний плід з надзвичайно коротким терміном зберігання. Це багате джерело оздоровчих сполук, таких як антоціани. Швидке зниження якості плодів, як правило, відбувається внаслідок розпаду та фізіологічної деградації, що пов’язано із втратою цілісності мембрани, що призводить до прогресування старіння та стресу. 1 Фосфоліпаза D (PLD), фермент, що розкладає фосфоліпіди, є ключовим ферментом, що бере участь у ініціюванні каскаду катаболічних подій, що призводять до можливого пошкодження мембрани, і має високу активність у плодах інших ягід, таких як полуниця. 2, 3

Відповідні технології та методи підвищення стійкості після збору врожаю високі. Застосування гексаналу як препарату до або після збору врожаю показало багатообіцяючі результати у збільшенні терміну зберігання кількох фруктів, овочів та квітів. 4, 5, 6 Біохімічні та генетичні дослідження пом'якшення плодів показали, що обробка клітинної стінки є результатом скоординованої експресії кількох сімейств генів, що кодують білки, пов'язані з метаболізмом клітинної стінки, включаючи експансини, пектин-метилестерази, полігалактуронази, пектат-ліази β-галактозидазу, Ендо- (1,4) -β-D-глюканази α-арабозидази, р-ксилозидази, ксилоглюканази, ендотрансглюкозидази, ендо-маннанази. 7, 8, 9, 10, 11 Однак зусилля придушити експресію ферментів, що руйнують клітинну стінку, за допомогою генної інженерії не дали задовільних результатів, щоб ефективно запобігти розм'якшенню плодів. 12, 13

З білків, що зв’язують кальцій, анексини утворюють сімейство структурно споріднених білків, які виявляють залежне від кальцію зв’язування фосфоліпідів. Анексини - це розчинні білки, здатні зв'язувати Са 2+ або самостійно асоціюватися з мембранними фосфоліпідами. Секвенування геному показало, що анексини в рослинах включають невелику групу мультигенів з кількома членами, вісім у групі Arabidopsis thaliana 28 та дев'ять у групі Oryza sativa. Підвищена експресія певних анексинів у конкретних проблемах розвитку чи навколишнього середовища асоціює їх із сигналом Ca 2+ під час нодуляції, 30 ABA 31, 32 реакцій або холодної акліматизації. Можливість того, що анексини утворюють канали Са 2+, поряд із їх присутністю в волосках кореня та зоні розширення коренів, свідчить про роль у підвищенні концентрації цитоплазматичного кальцію ([Са 2+] цит), необхідної для росту або подовження кінчика. Встановлено, що рослинні анексини мають активність АТФази та ГТФази in vitro. 22, 34 AtANN1 було визначено in vitro як білок, що зв'язує АТФ. 35

У нашому попередньому дослідженні проаналізовано вплив гексаналу на відносні рівні транскрипції ряду генів, які, ймовірно, будуть пов'язані з ферментами, що руйнують клітинні стінки полуниці. 36 У цьому дослідженні ми повідомляємо, що механізм дії гексаналу затримується, затримуючи пошкодження мембрани та продовжуючи термін зберігання, використовуючи мультидисциплінарні підходи, включаючи фізіологічну, гістологічну та біохімічну характеристики. Схеми експресії трьох генів фосфоліпази D, п’яти членів гена анексину та чотирьох активаторів транскрипції, що зв’язують кальмодулін, були кількісно визначені методом qRT-PCR під час розвитку та дозрівання плодів у відповідь на застосування гексаналу. Скануючу електронну мікроскопію, а також енергетичну дисперсійну рентгенівську спектрометрію проводили для аналізу структурних та композиційних деталей оброблених та необроблених плодів. Крім того, активність фосфоліпази D тестували під час розвитку плодів та через шість днів після збору врожаю після застосування гексаналу.

результат

Фізико-хімічні властивості

Вплив гексаналу на якість плодів та фізіологічні параметри, що визначають довговічні властивості плодів малини, наведені в таблиці 1. Як і очікувалось, TSS збільшувався у міру наближення плодів до стиглості та протягом усього періоду зберігання як між обробленими, так і необробленими плодами (таблиця 1 ). ). Однак TA був відносно вищим під час збору врожаю і поступово зменшувався з попереднім зберіганням. Статистичний аналіз не показав значного впливу застосувань гексаналу на TA або TSS. Протягом 6-денного періоду зберігання кількість втрати ваги була значно нижчою у оброблених плодів після другого та третього днів після збору врожаю, а потім повернулася до аналогічного співвідношення в оброблених та контрольних плодах протягом решти періоду зберігання (Таблиця 1) . Незважаючи на незначний вплив гексаналу на втрату ваги плода, загальна втрата ваги при зберіганні становила 30,2% для необроблених плодів порівняно з 25,9% для оброблених плодів (таблиця 1).

Стіл в натуральну величину

Силу всмоктування плодів, силу розтягування, необхідну для видалення ягоди з контейнера, вимірювали і використовували як показник розм’якшення плодів. Застосування гексаналу значно збільшило міцність на розрив оброблених ягід порівняно з контролем (рис. 2). Всі плоди демонстрували постійне зниження міцності на розрив під час подальшого зберігання при 20 ° C, але швидкість втрат була значно нижчою у оброблених плодів порівняно з контролем протягом перших 4 днів періоду зберігання. Протягом перших чотирьох днів обробки після збору врожаю фрукти вимагали значно більшої сили, щоб витягти плоди з контейнера (1, 96–1, 49 Н) порівняно з контролем (1, 76–0, 98 Н). ) (Таблиця 1). За останні два дні після збору не спостерігалося значної різниці. У польових умовах було дуже помітно, що контрольні плоди падали на землю, тоді як оброблений гексанал залишався прикріпленим і все ще вимагав мінімального зусилля, щоб відокремити його від контейнерів (додаткова фігура 1).

язано

Міцність на розрив у контрольній та обробленій гексаналом (HC) малині протягом шести днів після збору врожаю. Кожне значення являє собою середнє значення двадцяти п’яти вимірювань сили розтягу, необхідної для вилучення контейнерів із їх плодів. Зірочки вказують на значні відмінності між контролем та лікуванням гексаналом одночасно (P = 0,05).

Повнорозмірне зображення

Для кращого розуміння механізмів кореляції між застосуванням гексаналу та підвищеним утриманням плодів було проведено аналіз скануючого електронного мікроскопа (SEM). Цей аналіз показав рясне скупчення епідермальних волосків на кінчику оброблених плодових судин, тоді як на кінчику необробленої тварини не спостерігалося епідермальних волосків (рис. 3). Епідермальне волосся було присутнім у подібних кількостях на основі оброблених та контрольних контейнерів для фруктів.

Гістологічні спостереження судин малини з використанням SEM-аналізу. ( a, c a e ) становлять контроль, тоді як ( b, d a f ) являють собою плоди, оброблені гексаналом (HC). ( e a f ): більше збільшення кінчиків контейнерів, які демонструють рясні епідермальні волосся на обробленому гексаналі ( f ), без епідермальних волосків у контрольних контейнерах для фруктів ( e ). Шкала 500 мкм.

Повнорозмірне зображення

Експресія гена змінена гексаналом

Структури експресії трьох генів фосфоліпази D, п’яти генів анексину та чотирьох активаторів транскрипції, що зв’язують кальмодулін, були кількісно оцінені під час розвитку та дозрівання плодів у відповідь на застосування гексаналу. П'ять членів групи анексинів продемонстрували стійке підвищення рівня транскриптів на всіх етапах розвитку плодів. (Рисунки 4a - e). Усі гени анексину демонстрували однакову тенденцію з вищими розмірами для Ann2 та Ann5. Ця картина була поширеною серед лікуваних та необроблених плодів, але гексанал значно підвищував рівень транскрипту Ann3 на середній та пізній стадіях розвитку (рис. 4в). Аналіз даних експресії чотирьох членів активатора транскрипції, що зв’язує кальмодулін, показав, що рівень їх транскриптів досяг піку на середній стадії розвитку плодів, а потім знизився (рис. 4f-i). Плоди, оброблені гексаном, не показали жодної реакції, за винятком значно вищого збільшення середньої та пізньої стадії cAMTA3 та пізньої стадії cAMTA5 (малюнки 4g та i).

Схема експресії транскрипту, виміряна qRT-ПЛР п'яти членів гена анексину ( a - e ), чотири активатори транскрипції, що зв’язують кальмодулін ( f - i ) і три гени фосфоліпази D ( j - л ) під час розвитку плодів малини. Експресію визначали у порівнянні з трьома вітчизняними генами (His3, GPDH та Actin). Дані представляють середнє значення (± стандартне відхилення, sd) чотирьох біологічних повторень, кожна з яких має три технічні повтори. Статистично значущі відмінності від контролю (Cont) та гексаналу (HC) на одній стадії розвитку плодів позначені (*) для рівнів ймовірності (P

Застосування гексаналу змінило рівні транскриптів кількох генів, що беруть участь у дозріванні плодів малини. Транскрипти оцінювали за допомогою qRT-PCR п'яти членів гена анексину ( a - e ), чотири активатори транскрипції, що зв’язують кальмодулін ( f - i ) і три гени фосфоліпази D ( j - л ) протягом шести днів після збору. Усі плоди зберігали при 20 ° C до відбору проб. Дані представляють середнє значення (± sd) чотирьох біологічних повторень, кожна з яких має три технічні повтори. Дані експресії нормалізували за допомогою трьох підтримуючих генів (His3, GAPDH та Actin). Статистично значущі відмінності від контролю (Cont) та гексаналу (HC) того самого дня після збору позначені (*) та (**) для рівнів ймовірності (P

Структурні спостереження плодів малини малини за методом SEM-EDS. Порівняння епідермальних волосків плодової м’якоті, оброблених гексаналом ( a ) та контрольні фрукти ( b ) на середньому етапі розвитку. ( c ) показує збільшене зображення сильно локалізованих структур осадження кристалів, що спостерігаються на оброблених випитих епідермальних волосках. d ) відображення вихідних даних, що генеруються з графіків вихідного спектра аналізу EVS. Кожне значення представляє середнє значення дванадцяти зразків. Аналіз EDS проводили на необроблених плодах (контроль), HC- ( d ): оброблений гексаналом, що має структуру осадження, HC-ND: гексанал, оброблений в некристалічній області. Зірочки вказують на значні відмінності в рівні кальцію (P ⩽ 0, 01).

Повнорозмірне зображення

SEM-аналіз, що показує внутрішню будову плодових кістянок малини. а) ab ): контрольний фрукт, c a d ): фрукти, оброблені гексаналом. Зображення були зроблені у плодів середньої стадії. Внаслідок застосування гексаналу ніякої різниці у внутрішній будові плодів не спостерігалося. Положення насіння та стиків між кісточками показано на малюнках ( змінного струму ).

Повнорозмірне зображення

На закінчення, вплив гексаналу на зміну структури плодів залежав від стадії розвитку і виключно від екзокарпів та епідермального волосся.

Зміни в активності PLD під час та після розвитку плодів

Щоб оцінити потенційну роль гексаналу в інгібуванні фосфоліпази D та продовженні терміну зберігання, активність PLD тестували на різних стадіях розвитку плодів малини. У цьому колориметричному аналізі фосфатидилхолін перетворюється на холін за допомогою PLD, де холін потім окислюється холін-оксидазою. Інтенсивність забарвленого продукту реакції прямо пропорційна активності PLD у зразку.

Часткове пояснення цього збільшення утримання плодів було знайдено за допомогою SEM-аналізу, який показує рясні епідермальні волоски на кінчиках оброблених контейнерів для фруктів, тим самим збільшуючи зв’язок між фруктами та його контейнерами, збільшуючи тим самим силу, необхідну для видалення контейнера з фруктами .

Встановлено, що чутливі до кальцію білки, які називаються кальмодулінами, регулюють збільшення та дозрівання помідорів. 50, 51 Один з важливих висновків дослідження Янга та співавт. 51 було те, що придушення генів кальмодуліну може бути критичним для ініціювання незалежного від етилену процесу дозрівання. У цьому дослідженні експресія трьох активаторів транскрипції, що зв’язують кальмодулін (cAMTA1, cAMTA4 та cAMTA5), диференційовано змінювалася у відповідь на застосування гексаналу, що посилює сліди потенційного впливу гексаналу на зв’язуючі кальцій білки, які діють як сигнальні датчики.

Наші дослідження також демонструють чітку кореляцію між активністю PLD та експресією генів PLD на різних етапах розвитку плодів малини, а також під час зберігання. Подібний аналіз був проведений із використанням нормальної та антисмислової PLD у помідорах "Знаменитості". Ці результати переконливо показали, що експресія PLD знижувалась під час дозрівання плодів введенням антисмислової альфа-кДНК PLD у помідори «Celebrity». Обробка гексаналом спричинила чітке пригнічення активності PLD у плодах малини способом, подібним до антисмислових ліній PLD томатів, показав знижений рівень активності PLD. У тому ж звіті виявлено, що активність мікросомальної PLD у мембранах плодів полуниці стимулюється кальцієм. Ці результати, разом з нашими результатами, демонструють чітку кореляцію між застосуванням гексаналу, клітинною стимуляцією кальцію та пригніченням активності PLD. Однак повна послідовність подій передачі сигналу, задіяних у цьому зв'язку, вимагає подальшого дослідження.

Хоча малина виглядає дуже чутливою системою для застосування гексаналу, явище попередньої обробки гексаналом до шкіри виявляється дуже важливим для модуляції гальмування PLD та досягнення оптимального ефекту. Наприклад, гістологічні спостереження показують, що відкладення кальцію відбувається лише тоді, коли плоди обробляються на їх проміжній стадії розвитку. Місран та ін. 39 також вказали, що стадія вживання фруктів є вирішальною, оскільки інгібування PLD має дуже слабкий ефект, коли мембрана починає погіршуватися і починаються катаболічні ліпідні каскади. Наприклад, плоди томатів обробляють у стиглої зеленій фазі, щоб досягти найкращих результатів щодо розвитку кольору та смаку. Як ягоди, такі як вишня, слід обробляти приблизно за 15 днів до збору врожаю, щоб максимізувати термін їх зберігання до 30 днів при 4 ° C. 5

На закінчення ця робота чітко продемонструвала важливу роль, яку гексанал може відігравати у зниженні рівня транскриптів та активності PLD, а також у зміні деяких кальцієзв'язуючих білків, які функціонують як сигнальні датчики. Таким чином, застосування гексаналу може бути бажаною та придатною технологією для збільшення терміну зберігання малини після складання в надзвичайно швидкопсувному світлі. Гексанал, незважаючи на свою хімічно схильну назву, є природною сполукою, яку всі рослини виробляють як летючий захисний механізм. Це також суміш GRAS (як правило, вважається безпечною), затверджена FDA як дієтична добавка. 52 Ці дві характеристики повинні полегшити будь-яке занепокоєння, яке може виникнути у споживачів при використанні його на їстівних продуктах, таких як малина. Також було б цікаво визначити, чи накопичення кальцію внаслідок застосування гексаналу впливає на їстівну якість та смак плодів. Подальші дослідження можуть бути використані для формування розуміння біохімічного механізму взаємодії між гексанальним та міжклітинним кальцієм у загальній регуляції ЛПД при продовженні терміну зберігання фруктів.