предметів
реферат
Аторвастатин - це загальновживаний препарат для зниження рівня холестерину для лікування гіперхолестеринемії. Він інгібує 3-гідрокси-3-метилглутарил-кофермент А-редуктазу (HMG-CoA), фермент, який каталізує обмежувальну швидкість синтезу холестерину 11. Наскільки нам відомо, жодне опубліковане дослідження не було пов’язане із змінами ГМ при лікуванні аторвастатином на моделі HHD-індукованої гіперхолестеринемічної щури. Нашою метою було визначити, як ГМ реагує на індуковане аторвастатином зниження рівня холестерину в моделі HFD-індукованої гіперхолестеринемічної щури. Зокрема, ми прагнули визначити, чи може медикаментозне лікування впливати на склад ГМ та різноманітність щурів з гіперхолестеринемією порівняно зі здоровими групами контролю.
результат
Аналіз гіперхолестеринемії та медикаментозне лікування
Гіперхолестеринемія була підтверджена через 5 тижнів годування HFD із підвищеним рівнем холестерину в сироватці крові. Рівень холестерину (P 
Відносна чисельність, виражена у відсотках домінуючої та/або загальноприйнятої бактеріальної філософії між різними групами дієти та наркотиків. Точки відбору для відбору домінуючої філи були встановлені на рівні> 1%, і загальноприсутні таксони були виявлені у> 50% щурів у групі. НИЗ, нормальне харчування; НИЗ-Т, нормальна дієта + лікування аторвастатином; HFD, дієта з високим вмістом жиру; 5 мг/кг, HFD + 5 мг/кг аторвастатину; 10 мг/кг, HFD + 10 мг/кг аторвастатину; 15 мг/кг, HFD + 15 мг/кг аторвастатину; 20 мг/кг, HFD + 20 мг/кг аторвастатину.
Повнорозмірне зображення
Зміна мікрофлори кишечника у відповідь на HFD
Зміна дози залежно від таксонів у групі аторвастатину порівняно з контролем
Відносна кількість протеобактерій була значною (P
Багатовимірна фундаментальна координація аналізу складу мікробних спільнот між різними групами. PCoA проводили з послідовностей на рівні OTU із подібністю> 97%, використовуючи незважену метрику відстані UniFrac. НИЗ, нормальне харчування; НИЗ-Т, нормальна дієта + лікування аторвастатином; HFD, дієта з високим вмістом жиру; 5 мг/кг, HFD + 5 мг/кг аторвастатину; 10 мг/кг, HFD + 10 мг/кг аторвастатину; 15 мг/кг, HFD + 15 мг/кг аторвастатину; 20 мг/кг, HFD + 20 мг/кг аторвастатину.
Повнорозмірне зображення
Звучить аналіз різноманітності альфа-послідовності. ( A ) Рідкісні криві експериментально спостерігається OTU проти ( B ) оцінено за допомогою Chao1. ( C. ) Біорізноманіття оцінюється за індексом Шеннона. НИЗ, нормальне харчування; НИЗ-Т, нормальна дієта + лікування аторвастатином; HFD, дієта з високим вмістом жиру; 5 мг/кг, HFD + 5 мг/кг аторвастатину; 10 мг/кг, HFD + 10 мг/кг аторвастатину; 15 мг/кг, HFD + 15 мг/кг аторвастатину; 20 мг/кг, HFD + 20 мг/кг аторвастатину.
Повнорозмірне зображення
Як і в групах HFD, відносна чисельність штаму протеобактерій, сімейств (Porphyromonadaceae, Desulfovibrionaceae та Helicobacteraceae) та роду Helicobacter зросла в групі NCD-T порівняно з контрольною групою NCD. Крім того, Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Spirochaetaceae та Eubacteriaceae продемонстрували значне збільшення групи NCD-T порівняно з контролем NCD (Додаткова таблиця 2). Подібним чином у групі NCD-T зростали роди родів Treponema, Lachnoclostridium, Barnesiella, Ruminococcus, Eubacterium, Desulfovibrio та Roseburia. У той час як серед домінуючих родів відносна кількість осцилоспір, превотелл, бактеріоїдів і парабактероїдів була зменшена в групі NCD-T порівняно з контролем NCD (Додаткова таблиця 3).
Співвідношення між статтю та рівнем холестерину
Загальну кореляцію з рівнем холестерину проводили за допомогою непараметричного кореляційного аналізу Спірмена. Встановлено, що домінантні таксони, які були змінені в групах NCD-T, HFD, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг та 20 мг/кг, корелюють з різними холестеролами. Гени, які негативно корелювали з рівнями ЛПНЩ (ρ> −0, 17), TG (ρ> −0, 14) та рівня холестерину (ρ> −0, 27), включають клостридій, десульфовібріо, розубурію, блаутію, хелікобактер, румінокок та Лактобактерії (рис. 5). ). Однак виявлено, що превотелла, копрокок, превотелла [YRC22], парапревотелла, клостридії [SMB53] та дорея позитивно корелюють з ЛПНЩ (ρ> 0, 2), TG (ρ> 0, 1) та холестерином (ρ> 0) рівнів, 26) (рис. 5). Аналогічно, Осцилспіра (ρ> 0, 33) показала позитивну кореляцію з рівнем ЛПВЩ (рис. 5).
Загалом, зменшена відносна кількість Clostridiaceae, Lactobacillaceae, Rikenellaceae, Peptostreptococcaceae та Lachnospiraceae спостерігалася при різних дозах лікування аторвастатином у групі HFD. Ван та співавт. повідомляється про зниження рівня Clostridiaceae після введення пробіотичних штамів бактерій (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus та Bifidobacterium animalis) мишам, які отримували HFD 28. Подібним чином, введення неферментованої волокнистої гідроксипропілметилцелюлози мишам, яким годували HFD, або перехід на дієту з низьким вмістом жиру зменшив частоту захворювань Lachnospiraceae 29. На відміну від цього, у групах, які отримували наркотики, спостерігалося збільшення захворюваності на порфіромонадні, румінококкові та десульфовібріонацеае. Введення Lactobacillus paracasei мишам Apo-E -/- суттєво знижує рівень холестерину та збільшує поширеність Porphyromonadaceae у фекаліях 30. Миші HFD з добавкою капсаїцину мали підвищену частоту захворювання Ruminococcaceae 31. Подібним чином дієта з високим вмістом жиру/холестерину, доповнена активним Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri активним Lactobacillus reuteri, активним для солей жовчі, збільшує кількість десульфовібріонацеа 25 .
Лікування аторвастатином у групі з HFD збільшило відносну частоту розвитку бактеріоїдів та парабактероїдів. Бактероїди та парабактероїди мали максимальну кількість в 10 мг/кг та 15 мг/кг. Подібним чином, введення лізонів мишам ApoE -/-, що харчуються HFD, підвищувало рівень Bacteroides і Parabacteroides разом із зниженням рівня TG32. Бактероїди пов'язані з метаболізмом жовчних кислот і сприяють декон'югації кон'югованої з таурином жовчної кислоти, присутньої в сироватці крові 18, 33. Дієта з високим рівнем холестерину/холевої кислоти модифікувала склад фекальної жовчної кислоти 34, а змінена жовчна кислота була пов’язана з дисбіозом 35. Рівень десульфовібріо (бактерії, що продукують ендотоксин та бактерії, що відновлюють сульфат) 36, 37 показав підвищену відносну кількість в групі НИЗ-Т.
Подібним чином, рід Parabacteroides, який містить протизапальні бактерії 38, продемонстрував постійне збільшення відносної чисельності при різних дозах аторвастатину в групі HFD. Румінококи (бактерії, що продукують триптамін) 39 продемонстрували пригнічений рівень лікування аторвастатином у щурів, що годувались HFD. Рід Oscillospira, до складу якого входять 40-продуцирующие бутират, продемонстрував постійне збільшення групи HFD, які отримували лікарські засоби. Лікування рапаміцином (регулятором споживання та накопичення енергії) у індукованих HFD щурів із ожирінням призвело до підвищення рівня Turicibacter 41. У нашому дослідженні ми виявили знижений рівень Turicibacter у групах HFD, які отримували препарат. Подібним чином Clostridium (таксони, що виробляють бутират) 42 продемонстрував знижений рівень у групі, яка отримувала наркотики. Відповідно до наших висновків, Di Lucci et. ін. повідомили про збільшення захворюваності копрококом на багатий фруктозою метаболічний синдром у моделі ожиріння щурів 43 .
Кетрі та ін. повідомляли про підвищений рівень видів Lactobacillus після введення езетимібу та симвастатину мишам, що годували НИЗ. У групі NCD-T ми спостерігали збільшення відносної захворюваності на лактобактерії. Здібність бактерій Lactobacillus, що знижують рівень холестерину, раніше була продемонстрована шляхом введення Lactobacillus reuteri LR6, Lactobacillus reuteri NCIMB 30242 та Lactobacillus johnsonii BS15 щурам та пацієнтам із гіперхолестеринемією та на мишачій моделі неалкогольної жирної хвороби. визначити його точну роль у метаболізмі холестерину. Під час лікування аторвастатином ми прагнули співвіднести рівень холестерину у щурів із відносною кількістю потенційних бактерій, що знижують рівень холестерину. Обмеженням нашого дослідження була відсутність даних про метаболоміку. Застосування цього засобу може надати детальний зв’язок між складом метаболітів сироватки та мікробіомом щодо лікування аторвастатином.
Загалом, це дослідження показало вплив аторвастатину на ГМ-модель тваринного типу HFD. Зокрема, введення аторвастатину збільшило бактеріальну різноманітність і повернуло відносну кількість кількох домінуючих таксонів, які були змінені HFD у бік фенотипу НИЗ. Лікування аторвастатином також спричинило специфічний вплив препарату на розподіл популяції певних бактерій у групах лікування HFD та NCD-T. Різні класи препаратів, що знижують рівень холестерину, можуть спричинити різний вплив на мікробіол кишечника та забезпечити потенційний зв’язок між складом ГМ, рівнем холестерину та медикаментозним лікуванням. На закінчення слід сказати, що препарати, що знижують рівень холестерину, які зазвичай призначають під час гіперхолестеринемії, повинні бути проаналізовані на наявність мікробіомодифікуючих ефектів, які можуть мати значний вплив на здоров’я господаря.
Матеріал та реактиви
Модель тварини та лікування
Сорок два щури Wistar без патогенів (100-120 г) були надані Департаментом біохімії Університету короля Абдулазіза, Джидда, Саудівська Аравія. HFD містив 3% холестерину (Sigma Aldrich Co., США), 0,2% холевої кислоти (Sigma Aldrich Co., США), 15% яловичого жиру та 81,8% нормальних кормів. Всі додані інгредієнти брали у відсотках від загальної дієти. Аторвастатин (Pfizer Inc., США) використовували як препарат, що знижує рівень холестерину. Всі експерименти на тваринах у цьому дослідженні проводились на тваринах з приміщень кафедри біохімії факультету природничих наук Університету короля Абдулазіза. Протокол дослідження був затверджений Комісією з питань етики медичного факультету Університету короля Абдулазіза під номером угоди (реєстраційний номер HA-02-J-008). Експеримент проводився відповідно до затверджених рекомендацій.
Щури були акліматизовані до стандартизованих параметрів навколишнього середовища для тварин протягом 7 днів, включаючи температуру (21 ± 1 ° C), відносну вологість (60 ± 10%) та 12-годинний денно-нічний цикл. Навколишні умови для тварин зберігалися до кінця експерименту. Спочатку 42 щурів були випадковим чином розділені на дві групи і їх годували або звичайною дієтою (НИЗ; n = 12), або дієтою з високим вмістом жиру (HFD; n = 30). Гіперхолестеринемія підтвердилася через 5 тижнів лікування ВЧС. З групи NCD шість щурів отримували 10 мг/кг/день аторвастатину (NCD-T), тоді як інші шість щурів підтримували як контроль NCD. У індукованій HFD групі гіперхолестеринемічної групи шість щурів служили контролями HFD, а решта 24 щури були розділені на чотири рівні групи та оброблені різними концентраціями аторвастатину (5, 10, 15 або 20 мг/кг/день). Аторвастатин суспендували у розрахунковій кількості стерильної дистильованої води за допомогою магнітної мішалки, і препарат вводили внутрішньошлунково один раз на 24 години за допомогою зонда 47. Тварин лікували аторвастатином протягом 28 днів.
Аналіз крові та тканин та аналіз рівня холестерину
Зразки крові відбирали з орбітального сплетення у два часові моменти: через 5 тижнів для підтвердження гіперхолестеринемії у групі з HFD та перед забоєм для оцінки впливу медикаментозного лікування на рівень холестерину в досліджуваних групах. Сироватки виділяли із зразків крові центрифугуванням при 3000 об/хв при 4 ° С протягом 15 хвилин. Ліпідні профілі, включаючи сироватковий ЛПНЩ, холестерин, ТГ та ЛПВЩ, тестували за допомогою автоматичного біохімічного аналізатора (Aeroset 09D0501, американський). Вміст сліпої кишки збирали у всіх тварин відразу після забою і зберігали при -80 ° C для виділення ДНК.
Послідовність 16S рРНК та обробка даних
Метагеномну ДНК витягували із вмісту сліпої кишки за допомогою набору для екстракції ДНК AccuVisBio (AccuVisBio, Абу-Дабі) відповідно до інструкцій виробника, а концентрацію ДНК вимірювали за допомогою системи Qubit (Invitrogen, США). Проби секвенували для 16 генів рРНК, націлюючи на область V3-V4, використовуючи штрих-коди універсальних праймерів 341 F та 785 R згідно з процедурою Dowda et al. 48. Для підключення зчитувачів через обмежений цикл ПЛР використовували подвійний індексний штрих-код та адаптери послідовності Illumina. Після очищення бісером Agencourt AMPure (Agencourt, США) бібліотеки нормалізували, використовуючи протокол Nextera XT. Зразки об'єднували в одну проточну комірку для секвенування на платформі секвенування MiSeq (Illumina, Сан-Дієго) згідно з протоколом виробника. Автоматизоване формування кластера та послідовне сполучення з подвійним індексуванням виконувались за один цикл з довжиною зчитування 2 x 300 bp.
Парні кінцеві показання збирали з використанням файлів PANDAseq та Raw FASTQ, отриманих з Illumina MiSeq 49. Праймери та штрих-коди були видалені з послідовностей. Усі читачі з буквою 'N' та ті, що мають послідовності 50. Потім очищені послідовності кластеризувались при k = 10 (схожість 97%) з подальшим видаленням химер, і синглтон читав 51,52. Нарешті, OTU класифікували за допомогою QIIME 1.9 щодо лікувальної бази даних, отриманої з GreenGenes 53. Дані послідовності цього дослідження доступні в Європейському архіві нуклеотидів за проектом №. PRJEB23060.
Статистичний аналіз
Біорізноманіття та багатство OTU були розраховані за допомогою QIIME 1.9, реалізованого з непараметричним аналізом Chao1 та аналізом розбавлення, який показав однорідність та розподіл OTU у різних групах. Дані нормалізували до однакової кількості показань на зразок, і PCoA проводили з послідовностей на рівні OTU із подібністю> 97%, використовуючи незважену метрику відстані UniFrac. Графік PCOA візуалізував EMPEROR. Односторонні ANOVA (для параметричних даних) та непараметричні тести Крускала-Уолліса та Манна-Уітні (для нестандартних даних) були проведені для виявлення суттєво різних бактеріальних таксонів між різними групами, тоді як тест Колмогорова-Смірнова D визначити нормальність. даних. Для статистичного аналізу використовували версію 16 SPSS. Відмінності рівнів холестерину між контрольною та обробленою групами аналізували за допомогою t-тесту Стьюдента (двосторонній) із використанням GraphPad Prism версії 6.01 (Graph Pad Software, Сан-Дієго, США), а суттєві відмінності позначали як