предметів

реферат

Головний

Зі швидким збільшенням використання та постійним прогресом у поперечному перерізі зображень черевної порожнини виявлення кіст підшлункової залози стає все більш поширеним. Повідомляється, що кісти підшлункової залози ідентифікують у 1,2–2,6% комп’ютерної томографії черевної порожнини. Поширеність зростає з віком, і до 24% пацієнтів при розтині мають кісти підшлункової залози. 3 Історично вважалося, що псевдокісти становлять більшість кіст підшлункової залози, але більшість з цих уражень є кістозними новоутвореннями. Багато з цих новоутворень, включаючи серозні цистаденоми, є доброякісними та можуть контролюватися клінічно. Навпаки, внутрішньопротокові папілярні муцинозні новоутворення (IPMN) та муцинозні кістозні новоутворення (MCN) мають потенціал прогресувати до інвазивної аденокарциноми підшлункової залози. 4, 5, 6, 7 Згодом були розроблені та нещодавно оновлені керівні принципи міжнародного консенсусу щодо управління IPMN та MCN. 8, 9 Тому точний діагноз має вирішальне значення для належного догляду за пацієнтом.

Після дослідження PANDA ми інтегрували мутаційний аналіз KRAS як частину планової оцінки кістозних новоутворень підшлункової залози. У цій роботі ми повідомляємо про наш клінічний та патологічний досвід тестування KRAS, щоб: (1) виявити поширеність мутацій кіст у великому обсязі обслуговування кісти підшлункової залози; (2) оцінити роль тесту KRAS у диференціації муцинозних та немуцинозних кіст; та (3) співвідносить аналіз KRAS з іншими прийнятими діагностичними методами при діагностиці кістозних новоутворень підшлункової залози.

Матеріали і методи

справ

Схвалення дослідження було отримано від Ради інституційного огляду Університету Пітсбурга. Дані збирали у всіх випадках, коли рідину підшлункової залози вводили в Медичний центр Університету Пітсбурга, відділ молекулярно-анатомічної патології для аналізу KRAS. Ендоскопічна ультразвукова аспірація, отримана з тонкої голки, була отримана від пацієнтів, які спостерігалися в Медичному центрі Пітсбурга з листопада 2006 року по жовтень 2012 року. У всіх випадках зразки були представлені ендоскопом через невизначеність щодо того, чи є кіста підшлункової залози кістозним новоутворенням. Наприклад, пацієнти з псевдокістами, які мали документально підтверджену травму черевної порожнини, часто виключали з прийому рідини. Пацієнти з високою клінічною підозрою на ІПМН головного каналу шляхом ендоскопії та візуалізації також утримались від аналізу, оскільки додаткове тестування не вплине на ведення пацієнта. Були переглянуті медичні записи, щоб задокументувати демографічні показники пацієнта, результати ендоскопічного ультразвукового дослідження, в’язкість рідини (як зафіксовано ендоскопом), аналіз СЕА та цитопатологічні діагнози.

На момент ендоскопічної аспірації тонкої голки ультразвуком, якщо рідина кісти підшлункової залози становила приблизно 750 мкл або більше, спочатку принаймні 500 мкл розкладали для аналізу CEA, 200 мкл для молекулярного аналізу, а решту для цитології, що включає промивання голки . У деяких випадках також оцінювали амілазу. У випадках, коли кісткової рідини було від 200 до 750 мкл, пріоритет віддавався цитології, яка включає промивання голки та 200 мкл для молекулярного аналізу; для CEA рідина не подавалась через недостатню кількість рідини для аналізу. 9 Враховуючи часові рамки дослідження, нещодавно опубліковані керівні принципи Міжнародного консенсусу 2012 року не застосовувались суворо при оцінці критеріїв операції. Після резекції досліджували предметні стекла, пофарбовані гематоксиліном та еозином, для підтвердження гістологічного діагнозу або для оцінки ступеня дисплазії та класифікації гістологічного підтипу резектованих IPMN. 13

Аналіз CEA

Рівень СЕА підшлункової залози оцінювали за допомогою двомісного імуноферментного аналізу "сендвіч", використовуючи два моноклональні анти-СЕА антитіла, які реагують з різними епітопами СЕА. Цей аналіз проводили на Beckman Coulter Unicel DXI 800. Перед аналізом зразки центрифугували протягом 2 годин і до реакційної посудини додавали не менше 500 мкл (оптимально 1 мл) безклітинного зразка. У всіх випадках тестування проводили протягом 24 годин після тонкої голкової аспірації кісти підшлункової залози. Кількість CEA, присутній у зразку, визначали за допомогою збереженої багатоточкової калібрувальної кривої.

Аналіз мутації KRAS

Загальну ДНК геному виділяли з 200 мкл рідини цисти шляхом поділу колонки згідно з інструкціями виробника (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США). Кількість виділеної ДНК визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Для виявлення мутацій 10-50 нг ДНК ампліфікували праймерами, фланкуючими екзон 2 гена KRAS (прямий праймер 5'-GGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 'і зворотний праймер 5'-TCCTGCACCAGTAATATGCA-3') і екзон 3 'гена KRAS TGAAGTAAAAGGTGCACTG-3 'і зворотний праймер 5'-GCATGGCATTAGCAAAGACTC-3'). Потім продукти ПЛР секвенували як у сенсі, так і в антисмислових напрямках, використовуючи комплект циклічної послідовності BigDye Terminator v3.1 на ABI 3730 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США) відповідно до інструкцій виробника. Електроферограми послідовностей аналізували за допомогою програмного забезпечення Mutation Surveyor (SoftGenetics, LLC, State College, PA, USA). Кожен випадок класифікували як позитивний чи негативний для мутації KRAS на основі результатів секвенування.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз для оцінки відмінностей між мутантними кістами KRAS та щурами CRAS порівнювали за допомогою точного тесту Фішера на дихотомічні змінні. Всі тести були двосторонніми, а статистична значимість визначалася як величина Р

карстового

KRAS - мутантна гілка, внутрішньопротокове папілярне муцинозне новоутворення (IPMN). a ) Анехогенні та септичні кісти були виявлені в тілі підшлункової залози за допомогою ендоскопічного ультразвуку. Кіста вимірювала 1,8 см в максимальному поперечному діаметрі і не зв’язувалась з головним каналом. Після аспірації тонкою голкою рідина виявилася злегка в’язкою. b ) Цитологічні мазки були менш ніж оптимальними і в них виявляли переважно муцин з рідкісними гістіоцитами та лімфоцитами. Хворому була проведена дистальна панкреатектомія через випадкову нейроендокринну пухлину підшлункової залози, але кіста ( c, d ) узгоджується з розгалуженою протокою, IPMN з дисплазією низького ступеня та слизовою оболонкою шлунка.

Повнорозмірне зображення

Загалом 25 з 89 (28%) кіст типу KRAS були IPMN або IPMN-асоційованими аденокарциномами. Сюди входило 10 (40%) IPMN розгалужених каналів, 7 (28%) IPMN основних каналів, 3 (12%) змішаних основних та розгалужених IPMN-каналів та 5 (20%) аденокарцином, що виникають у зв'язку з IPMN. На підставі гістологічного підтипу 12 (48%) були шлунковими, 9 (36%) кишковими та 4 (16%) панкреатобіліарними. Подібно до мутантних ІРМН мутацій KRAS, дисплазія низького ступеня (11 із 25, 44%) була більш поширеною, за нею поміркована (n = 8, 32%) та висока (n = 6, 24%). Знову ж таки, щодо адекватності зразка як фактора для оцінки статусу мутації KRAS, 12 із 25 (48%) IPMN типу CRAS порівняно з 21 із 50 (42%) мутантних IPMN KRAS були менш оптимальними або незадовільними для цитопатологічного статусу. діагностика.

Серед резектованих IPMN не виявлено кореляції між статусом KRAS та статтю пацієнта (P = 0,22), середнім віком (P = 0,60), середнім розміром кісти (P = 0,52), розташуванням кісти (P = 0,46)., Кістозним вогнищем (P = 0,63), в’язкості рідини (P = 1,00), рівні CEA (P = 0,36) або середньої концентрації ДНК (P = 0,96). Однак поширеність мутацій KRAS була вищою в IPMN, що включало гілкування гілок (P = 0,03), гістологічний підтип шлунка (P = 0,01) та низьку ступінь невеликої дисплазії (P = 0,01). Крім того, відсутність мутацій KRAS корелювала з IPMN кишкового типу (P = 0,04).

Муцинозні кістозні новоутворення

Усі 22 MCN були ідентифіковані у жінок у віці від 20 до 75 років (у середньому 46, 9 років). Кісти розміром від 2,0 до 9,9 см (діаметр 4,5 см) розміщувались у дистальній частині підшлункової залози. П'ятнадцять (67%) знаходились у хвості підшлункової залози, тоді як 7 (33%) були в тілі. Ендоскопічна ультразвукова аспірація тонкою голкою показала, що рідина кісти була рідкою та водянистою у 10 (45%) випадках та в’язкою у 12 (55%). Аналіз CEA був проведений на 21 з 22 (95%) MCN і збільшений на 12 (55%). Під час резекції більшість МКН мали дисплазію низького ступеня (16 із 22,73%), тоді як решта мали дисплазію середнього ступеня (n = 6,29%). Загалом 3 з 22 (14%) MCN містили мутацію KRAS (рис. 2). Однак суттєвих відмінностей у демографічних показниках пацієнтів, результатах ендоскопічного ультразвукового дослідження, адекватності зразків, аналізі рідини кісти, середній концентрації ДНК або гістологічних характеристиках не спостерігалося порівняно з MCN типу KRAS. .

KRAS - мутантне муцинозне кістозне новоутворення (MCN). ( a Анехогенна та дистально-зміцнююча кіста була виявлена ​​в тілі/хвості підшлункової залози за допомогою ендоскопічного ультразвукового дослідження. Кіста вимірювала 6,5 см в максимальному поперечному діаметрі. Було виявлено кілька тонких відділень. Рідина, отримана аспірацією тонкою голкою, виявилася прозорою і тонкою. ( b ) Цитологічні мазки були менш ніж оптимальними, але зразок цитоспіну показав незначну кількість гістіоцитів на муциновому фоні відповідно до вмісту цисти. ( c, d ) Дистальний зразок панкреатектомії продемонстрував мультилокульовану кісту з муцинозною епітеліальною оболонкою. Ядра були однорідними і в основному орієнтованими. Під оболонкою кісти щільний стромар яєчників відповідав MCN.

Повнорозмірне зображення

Кореляція стану KRAS та інших результатів тонкої аспірації ендоскопічного ультразвуку з хірургічно резекованими IPMN та MCN

Загалом мутації KRAS мали специфічність 100% для муцинозної диференціації при хірургічно резектованих кістах підшлункової залози, але лише з чутливістю 54%. Для порівняння, збільшена в'язкість рідини та підвищений CEA мали меншу специфічність (69% та 85%), але вищу чутливість (68% та 62%). Цитопатологічний діагноз принаймні підозрюваних щодо новоутвореної муцинозної кісти мав подібну специфічність 73%, але значно нижчу чутливість 39%. Для IPMN наявність множинних кіст мала специфічність 59% та чутливість 80%. Поєднання точкових мутацій KRAS та підвищеного СЕА покращило чутливість обох аналізів до 83% та підтримало високу специфічність 85% щодо муцинозної диференціації. Додавання в’язкості рідини до KRAS та CEA підвищувало чутливість (90%), але з втратою специфічності (64%). Мультимодальний підхід з використанням KRAS, CEA, в’язкості рідини та цитології ще більше підвищував чутливість до 91%, але зменшував специфічність до 56%.

Коли стратифікований за типом кісти, KRAS мав специфічність та чутливість 95% та 67% для IPMN проти 58% та 14% для MCN. Хоча IPMN часто мультифокальні, мають тенденцію до підвищення CEA і часто демонструють підвищену в'язкість рідини, специфічність кожного параметра була нижчою (86%, 69% та 66%) порівняно з KRAS. Крім того, чутливість була або подібною, або дещо нижчою (48%, 68% та 63%). Щодо MCN, підвищений рівень CEA мав вищу специфічність (71% проти 58%) та чутливість (55% проти 14%), ніж KRAS. На відміну від цього, підвищена в’язкість рідини мала нижчу специфічність на 48%, але вищу чутливість на 55%. Усі MCN в цьому дослідженні були поодинокими.

обговорення

Дослідження PANDA було на сьогодні найбільшим багатоцентровим тестом для оцінки молекулярного аналізу рідини кісти підшлункової залози при діагностиці муцинозних кіст. До її складу увійшли 113 пацієнтів з кістами підшлункової залози, які перенесли хірургічну резекцію або мали діагностичну цитологічну аспірацію. ДНК кістозної рідини була отримана шляхом ендоскопічної аспірації тонкої голки та проаналізована в комерційній лабораторії Redpath Integrated Pathology (Пітсбург, Пенсільванія, США). Молекулярний аналіз включав кількісне визначення ДНК, тестування кодону KRAS 12 та аналіз аллельних втрат широкої панелі мікросателітних маркерів, включаючи секвенування. Мутації в кодоні KRAS 12 показали найвищий коефіцієнт шансів (20, 9) та специфічність (96%), але низьку чутливість (45%) до муцинозної диференціації. Для порівняння, підвищений СЕА мав специфічність та чутливість 83% та 64% відповідно. Аналіз мутації KRAS підвищив чутливість аналізу CEA з 64% до 82%, зберігаючи специфічність до 83%.

Намагаючись вирішити проблеми, що виникають під час дослідження PANDA, ми інтегрували тестування KRAS як частину планової оцінки кістозних новоутворень підшлункової залози як частину нашого великого обсягу послуг з кісти підшлункової залози. Поширеність мутацій кіст KRAS становила 38% протягом 6 років. На додаток до мутацій KRAS, розташованих на кодоні 12, ми також виявили мутації на кодонах 13 і 61. Хоча кореляційний гістологічний моніторинг був присутній лише у 25% пацієнтів, загалом було резековано 73 IPMN та 21 MCN. Крім того, більшість із цих муцинозних кіст (67%) виявляли дисплазію низького ступеня. Подібно до результатів дослідження PANDA, мутації KRAS мали високу специфічність (100%), але низьку чутливість (54%) до муцинозних кіст. Аналіз CEA мав специфічність 85% та чутливість 62%. У поєднанні обидва тести підвищували чутливість до 83%, зберігаючи при цьому високу специфічність 85%. Відтворюваність результатів дослідження PANDA щодо KRAS підтверджує його корисність у виявленні муцинозних кіст. У поєднанні з аналізом CEA, тестування KRAS може поліпшити діагностичний вихід тонкострілкових аспіратів кісти підшлункової залози.

Варто зазначити, що у нашому дослідженні все ще існує упередженість у відборі. Більш конкретно, тестування KRAS проводили на розсуд ендоскопа. Таким чином, кістозні рідини з псевдоцист у пацієнтів з травмою живота в анамнезі або прямими основними каналами IPMN за допомогою візуалізації були пропущені з аналізу KRAS. Однак можна стверджувати, що в цих умовах тестування молекулярних хелперів не потрібне. Примітно, що попередні дослідження показали, що класифікація рідини кісти на основі мутацій KRAS може призвести до хибнопозитивних результатів. Панареллі та ін. 15 виявили дві псевдокісти з мутацією KRAS, використовуючи ту саму комерційну панель біомаркерів (PathfinderTG), що і дослідження PANDA. Тому необхідно інтерпретувати результати KRAS як частину мультидисциплінарного підходу.

Соматичні мутації в KRAS є загальними як для IPMN, так і для MCN, і частота, що повідомляється, коливається від 30% при ураженнях низького ступеня тяжкості до 80% при ураженнях високого ступеня. 18, 19, 20, 21, 22 Відповідно до попередніх досліджень, поширеність мутацій KRAS в IPMN становила 67%. На відміну від цього, лише 14% MCN містили мутацію KRAS. Ці висновки можуть бути пов’язані з відсутністю чутливості в нашій техніці виявлення ДНК. Однак мутації KRAS в межах IPMN постійно ідентифікувались із порівнянною швидкістю як дослідження з використанням матеріалу хірургічної резекції або рідини післяопераційної кісти. В якості альтернативи, кількість ДНК з лізисованого та виділеного епітелію, отриманого при аспірації тонкої голки, може бути меншою, ніж кількість, виявлена ​​в післяопераційній аспірації внаслідок хірургічних маніпуляцій. Або лише 14% MCN в нашій досліджуваній групі насправді мають мутації KRAS. Якою б не була причина, необхідні додаткові маркери для поліпшення чутливості аналізу ДНК рідини кісти.

Важливим аспектом, який не розглядається в цьому дослідженні, є здатність ДНК-аналізу розрізняти ураження, що продукують муцин, із низькою ступенем дисплазії (доброякісною) від тих, що мають високоякісну дисплазію або асоційований інвазивний рак (злоякісне утворення). Мутації KRAS самі по собі не корелюють з вищим ступенем новоутворень, що продукують муцин. Дослідження PANDA повідомило, що аналіз множинних аллельних втрат> 82% або комбінація мутації KRAS та аналіз високих алельних втрат є високо прогнозуючими для злоякісності. Ці висновки були підтверджені Shen та співавт., 14 років, які проаналізували 35 зразків рідин кісти підшлункової залози за допомогою Redpath's PathfinderTG. Автори виявили 89% згоди між молекулярним та клінічним консенсусними діагнозами, включаючи 83% для злоякісних, 87% для доброякісних муцинозних та 93% для доброякісних нецукрових кіст. Навпаки, дослідження Panarelli та співавт. 15 та Толл та ін. 16 повідомили про рівень відповідності 39% та 56%. Широку варіативність узгодженості між молекулярним та клінічним діагнозами можна пояснити відсутністю даних про хірургічне спостереження в останніх двох дослідженнях. Однак, як і при аналізі KRAS, необхідні майбутні дослідження, що включають більш тривалі періоди спостереження та корельоване хірургічне спостереження.

Підсумовуючи, ми представляємо найбільшу серію аналізу KRAS на ендоскопічну ультразвукову аспірацію тонкою голкою, отриманою рідиною кісти підшлункової залози. У поєднанні з клінічними та рентгенологічними результатами KRAS був високоспецифічним, але мав слабку чутливість до муцинозної диференціації. Додавання аналізу CEA покращило чутливість аналізу KRAS, зберігаючи високу специфічність. Коли стратифікували за типом муцинозної кісти, тестування KRAS мало м’яку чутливість до IPMN, але було недостатньо для ідентифікації MCN. Подальші молекулярні дослідження, що включають додаткові гени та інші маркери рідини, необхідні для поліпшення виявлення та класифікації слизової підшлункової залози за допомогою тонкої голки ендоскопічного ультразвуку.