Джордж Бідл та Едвард Татум у своїх новаторських дослідженнях з грибом Neurospora запропонували співвідношення 1: 1: 1 між геном, ферментом та біохімічною реакцією. Але те, як нуклеотидна послідовність кожного гена була пов'язана з амінокислотною послідовністю його кодованого білка, залишалося питанням без відповіді.

було

У статті "Природа" 1961 року "Загальна природа генетичного кодексу білків" Френсіс Крик, Леслі Барнетт, Сідней Бреннер та Річард Ваттс-Тобін нарешті вирішили загадку. Вони правильно дійшли висновку, що генетичний код є потрійним кодом, код надлишковим (також його називають виродженим: надмірність або виродженість є особливістю генетичного коду, правилом відповідності між нуклеотидною послідовністю нуклеїнових кислот і послідовністю амінокислот поліпептидів; це стосується того факту, що існує більше різних кодонів, ніж потрібно для зберігання генетичної інформації), триплети не перекриваються, немає коми (хоча інтрони згодом були виявлені) і кожна послідовність нуклеотидів зчитується з починаючи з конкретної вихідної точки.

У 1961 р. Єдиною аналітичною процедурою, яка могла бути використана для впорядкування передбачуваної нуклеотидної послідовності гена, було картографування генетичних структур з використанням мутантів із змінами у зазначеному гені. Мутаційно змінені ділянки, відмічені цією процедурою, були передбачуваними місцями зміни нуклеотидів.

На щастя для Крика та його співробітників, наприкінці 1950-х років Сеймур Бенцер розробив елегантний аналіз з використанням мутацій в області rII фага T4 (який має 2 сусідні гени, звані цистронами A і B - цистрон є найменшою одиницею генетичного матеріалу здатний бути відповідальним за синтез поліпептиду). За допомогою цієї системи Бенцер надав першу детальну структурну карту генетичного регіону, в даному випадку генома фага.

Незважаючи на неможливість секвенувати ДНК, Крик та його колеги були впевнені, що він може використовувати мутагенез та генетичну рекомбінацію із системою T4 rII для картографування змінених ділянок у цій генетичній області та встановлення загальної природи генетичного коду.

Карта Бенцера регіону T4 rII відповідала висновку, що кожен ген складається з лінійної послідовності нуклеотидів, кожен з яких може зазнати спадкових змін, які можуть змінити білковий продукт. Те, що поліпептиди також складаються з лінійних амінокислотних послідовностей, було раніше встановлено Фредом Сангером та іншими.

Потім, у 1958 році Вернон Інграм показав, що мутантний поліпептид гемоглобіну людини мав лише одну зміну амінокислоти. Логічний висновок, отриманий з цих та суміжних досліджень, полягав у тому, що кожен ген складався з унікальної лінійної послідовності нуклеотидів і що ця послідовність була перетворена в унікальну лінійну послідовність амінокислот. Якщо це тлумачення було правильним, тоді мав бути «генетичний код», що пов'язує нуклеотидну послідовність кожного гена з амінокислотною послідовністю кодованого білка.

Крик запропонував гіпотезу "адаптера" - що конкретні молекули (пізніше ідентифіковані як тРНК) відповідають за "переведення" конкретної послідовності нуклеотидів у конкретну амінокислоту. Бреннер, у свою чергу, порівняв відомі амінокислотні послідовності білків і дійшов висновку, що генетичний код не може перекриватися (одна з кількох можливостей), оскільки кожна амінокислота може бути розташована поруч з кожною з інших 19 амінокислот.

Стратегія Крика щодо визначення того, який з потенційних "кодів" був правильним, базувалася на його переконанні, що клас мутагенів, акридинові барвники (наприклад, профлавін) спричиняють додавання пар основ або зменшення ДНК. На той час це не було поширеною думкою, але це підтверджувалось їхніми даними. Відповідно до цієї інтерпретації було зауваження, що мутації ДНК, спричинені акридином, мали незвичну характеристику: вони були тотальними або негерметичними (тобто мутація призвела до повної втрати функції генів). Це свідчило про те, що ці мутації перешкоджали належній трансляції області кодування до 3 'кінця (нижче за течією) місця мутації.

Далі Крик та його колеги міркували, що мутація, спричинена додаванням пари основ, може бути придушена внаслідок близької мутаційної зміни протилежного типу, видалення пари основ. Ця друга зміна відновила б "природну" рамку зчитування до кінця 3 'ділянки другої мутації. Таким чином, буде змінений лише поліпептидний сегмент, зазначений послідовністю ДНК між ділянками 2 мутаційних змін.

Вони перевірили ці прогнози, використовуючи мутант T4 rII, індукований профлавіном, який вони позначили як FC0. Вони довільно припустили, що цей мутант виник в результаті додавання пари основ (звана "+"). Ця мутація зіставлена ​​з місцем у певному сегменті цистрону B області T4 rII, що, за Бенцером, не було суттєвим для функції rII B. Значенням вибору цієї генетичної області для аналізу було очікування, що змінена послідовність амінокислот зазначена сегментом ДНК між змінами + (додавання пари основ) та - (видалення пари основ) зміни у вибраній області B не будуть шкідливими.

Дійсно, коли вони проводили свої первинні аналізи з відбором FC0 для мутацій, які відновлювали функцію rII +, вони спостерігали багато супресивних змін на другому сайті; вони нанесені на сусідні сайти по обидва боки від місця мутації FC0. Потім вони відокремили ці супресивні зміни від мутації FC0 за допомогою генетичної рекомбінації та спостерігали, що кожна зміна супресора, коли лише у rII B, також мала мутантний фенотип. Ці окремі супресивні зміни, як правило, були тотальними, що відповідало очікуванню, що кожна з них була пов’язана з видаленням базової пари.

Дослідники ізолювали супресори від цих супресорів; це повинні були бути додатки до пари основ, оскільки вони перевернули мутантний фенотип раніше ізольованих супресорів і вважали їх "поглиначами". Поєднуючи мутації в різних наборах, вони зауважили, що існували лише 2 класи: ті, які, здавалося, мали додавання пари основ і ті, які, здавалося, мали видалення пари основ.

Таким чином, мутаційна зміна в одному класі, в поєднанні з мутаційною зміною в тому ж класі, повинна продукувати мутантний фенотип, тоді як у поєднанні з сусідньою мутаційною зміною в другому класі спостерігатиметься фенотип rII +. Це було саме те, що вони виявили: більшість мутацій супресорів розташовувались відносно близько до місця первинної мутації "супресорів".

Здавалося, помилку читання, що призвела до додавання базової пари, можна було виправити лише видаленням сусідньої базової пари. Це свідчило про наявність нуклеотидного триплетного коду і про те, що деякі кодуючі триплети не можуть бути перекладені, можливо, слугуючи перекладом "максимумів". Автори також зауважили, що деякі їх комбінації +/- мали фенотип псевдодикого типу, що відповідає очікуванню, що деякі амінокислотні послідовності, зазначені сегментом ДНК між ділянками 2 мутаційних змін, можуть містити амінокислоту, яка був лише частково функціонально прийнятним у такому положенні.

Потім вони провели подальший аналіз, зосередившись на своїй головній меті, визначивши загальну природу генетичного коду. Вони розсудили, що якщо генетичним кодом є триплетний код, то поєднання 3 мутаційних змін + або 3 мутаційних змін - створить фаг із фенотипом дикого або псевдодикого типу. Саме те, що вони знайшли. У цих потрійних мутантах амінокислота, імовірно, була додана до білка В. або видалена з нього. Ці висновки дали вагомі докази, що підтверджують їхній висновок про те, що генетичний код - триплетний код.

Крик, Барнет, Бреннер і Уоттс-Тобін розробили подальший тест на логіку їх інтерпретацій, використовуючи, як видається, злиття генів. Вони ввели + та - мутаційні зміни в цистроні А спеціального делеційного мутанта під назвою 1589, в якому нечищений сегмент цистрону rII A вважався злитим з рештою частиною цистрону В. Однак цей мутаційний делеційний зберіг функцію білка В, що свідчить про залишок ДНК в цистроні В переводили у відповідну форму зчитування, отримуючи поліпептид АВ, який зберігав функцію В.

Зазвичай мутації цистрону А або В не впливають на експресію іншого цистрону, що узгоджується з тим, що rII A і rII B є окремими генами. Представляючи мутаційні зміни + або - в решті rII Частина мутанта делеції 1589 року, як і передбачалося, усунула активність rII B. Однак, коли зміни + та - були поєднані з областю 1589 rII A, активність B була відновлена. Ці результати узгоджувалися з висновком про те, що нуклеотидна послідовність гена перекладається лінійно, починаючи з фіксованої точки початку і продовжуючи, поки не зустрічався знак зупинки для трансляції.

Пізніше вони провели додаткові експерименти, щоб перевірити, чи може співвідношення ДНК-білок, що кодує, становити 6 нуклеотидів на амінокислоту замість 3 нуклеотидів на амінокислоту, яким вони надавали перевагу відповідно до своїх даних.

Усі їх висновки узгоджувались з висновком, що кожна мутація, спричинена акридином, передбачала додавання або видалення однієї пари основ, а не додавання або видалення 2-х пар основ. Однак вони визнали, що ці дослідження не повністю виключають можливість 6 нуклеотидів. Вони також стверджували, що їх результати більше відповідають надмірності коду. Оскільки існувало 64 (4x4x4) різних триплетних послідовностей і лише 20 амінокислот, 44 з цих триплетів, мабуть, кодували б високі послідовності або могли б виконувати якусь іншу функцію, якщо код не був зайвим. Якби 44 триплети були стоп-кодонами, автори вважали, що вони зіткнулися б із більшими труднощами при відновленні функції rII шляхом комбінування змін + та - мутацій. Оскільки багато мутаційних змін додавання та видалення були врятовані мутаціями видалення, стоп-кодон не міг бути введений між ними. Найбільш правдоподібним поясненням було те, що генетичний код надзвичайно зайвий.

Експериментальний аналіз, описаний у вашій статті, надзвичайно вагомий. В одному з останніх абзаців вони згадують заяву Маршалла Ніренберга на конгресі біохімії в Москві в 1961 р. Про те, що вони з Меттей додали РНК поліуридилової кислоти до безклітинної системи синтезу білка in vitro, виробляючи фенілаланін. Це означало існування деякої послідовності коду уридину для фенілаланіну і, що ще важливіше, що синтетичні РНК можна було перетворити в білки за допомогою цієї безклітинної системи.

Крик та ін. Також посилаються на іншу статтю Ніренберга та Маттея, в якій вони згадують у додатковій примітці, що "поліцитидилова кислота специфічно опосередковує включення L-проліну в осаджуваний продукт TCA (трихлороцтова кислота)".

Стаття Крика та співавторів 1961 року вражає тим, що вони правильно вивели загальну природу генетичного коду, незважаючи на їх неможливість розшифрувати генетичний код шляхом безпосереднього експериментального аналізу. Його аналізи були блискучими, а його висновки - неоціненним доповненням до наших знань про інформаційний зміст ДНК. Без сумніву, його висновки, мабуть, мали великий вплив на науковців галузі в його часи.

Це прекрасний приклад використання думки та логіки для вирішення основних біологічних проблем, поєднуючи знання та мудрість для відповіді на важливі наукові питання.