предметів

реферат

Протягом багатьох років археї вважалися або метаногенами, або екстремофілами. Однак за останні кілька десятиліть субодиниця малої рибосомної РНК (рРНК) та аналіз генів 16S рРНК в зразках навколишнього середовища виявили присутність архей в аеробних морських середовищах при помірних температурах (DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992). Ці археї (переважно належать до субдомену Crenarchaeota) були знайдені в грунтах (Birtrim et al., 1997), полярних морях (Murray et al., 1998), лиманах (Abreu et al., 2001), печерах (Gonzalez et al. ., 2006), широкий спектр океанічного середовища (DeLong et al., 1994; Stein and Simon, 1996; Massana et al., 1997; Massana et al., 2000; Karner et al., 2001), глибоководні відкладень (Vetriani et al., 1999; Teske et al., 2002; Søresnson and Teske, 2006; Biddle et al., 2008) та солончаків (Nelson et al., 2009). Незважаючи на те, що кренархеоти поширені у всьому світі і часто трапляються в різних середовищах, про їх метаболічні здібності відомо порівняно мало.

У цьому звіті представлені експерименти SIP, які демонструють включення 13C різних органічних субстратів членами Групи різних Кренархеот (Inagaki et al., 2003) та Морської Групи I (Vetriani et al., 2003). Наші результати демонструють, що солончак кренархеота здатний засвоювати широкий спектр органічних вуглецевих субстратів, які також використовуються бактеріальними популяціями in situ, що свідчить про конкуренцію між двома доменами. Крім того, є дані про розподіл ресурсів для сечовини та цілих білків. Цікаво, що для отримання чіткого SIP-сигналу для кренархеї потрібно мінімум 5 днів інкубації, що свідчить про відносно тривале (2-2, 5-денне) подвоєння часу порівняно з бактеріальною спільнотою. Ці висновки свідчать про те, що механізми зверху вниз і знизу вгору дозволяють стабільно співіснувати кренарії та бактерії в умовах солончаків.

Матеріали і методи

кренархеальна

Агарозний гель ампліконів гена рНР 16 С з 13 С-смуг: а1) порожній; а2) лямбда-ДНК; а3) негативний; а4) перевізник; а5) відсутність підкладки; а6) 13 С-ліпід (2 мг мл-1); а7) 13 С-ліпід (10 мг мл-1); а8) 13 С-білок (2 мг мл-1); а9) 13 С-білок (10 мг мл-1); a10) 13 C-ISOGRO (2 мг мл-1); a11) 13 C-ISOGRO (10 мг мл-1); а12) позитивний контроль; b1) лямбда-ДНК; б2) негативні; б3) 13 С-носій; b4) T0 (час = 0; зразок відібраний до лікування); б5) відсутність підкладки; b6) 12C-сечовина; б7) 13 С-сечовина; b8) 12C-бікарбонат; б9) 13 С-бікарбонат; b10) порожній; b11) тест на гальмування (позитивний плюс зразок); b12) позитивний контроль.

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Включення бактерій 13 С також можна виявити в експериментах SIP. Синтез бактеріальної 13-ДНК спостерігався у 83% мікросвіту, за винятком низьких концентрацій сечовини та ISOGRO (табл. 2). Порівняно тривалий час інкубації SIP (5 днів), швидше за все, дозволив екстенсивні перехресні бактерії (Gallagher et al., 2005) та 13 C-CO 2 (дані не наведені). Також проводили інкубацію з 13 C-бікарбонатом, щоб підтвердити, що кренархеї насправді поглинали 13 CO 2 замість 13 мічених C субстратами під час нашого експерименту SIP. Результати показані на малюнку 1b. Лікування 13 C-бікарбонатом не дало жодного кренархеального амплікона в 13 C-смузі (смуга 1b-9). Аналіз на інгібітори ПЛР шляхом збільшення позитивного зразка ДНК 13С-ДНК при інкубації з бікарбонатом не вказував на пригнічення ПЛР з цього екстракту (смуга 1b-11). Ці результати демонструють, що крапчастий сигнал SIP є результатом включення 13C-органічних речовин, а не міченого 13C бікарбонату, який продукувався бактеріальним диханням.

Стіл в натуральну величину

Приклад профілів TRFLP кренаріальних генів 16S рРНК у 12 С- та 13 С-смугах від зміни ліпідів. Виділені піки (сірий) відображаються в клоновій бібліотеці.

Повнорозмірне зображення

Компіляція відбитків пальців Cernarchaeal з TRF від 85 до 169 п.н. ( a ) та 170-254 bp ( b ). Великі розміри піків позначаються рамками (зафіксовано, виявлено в бібліотеці клонів; пунктирно, не виявлено). Світлі відтінки вказують на більш високі концентрації; темні відтінки вказують на нижчу концентрацію.

Повнорозмірне зображення

Визначено філогенетичну оцінку за допомогою дерева максимальних ймовірностей (PhyML) за підтримки 100 завантажувальних стріпсів. Клони в цьому дослідженні позначені номерами приєднання TRF та GenBank. Чорні крапки представляють послідовності, знайдені в прибережних або ротових відкладах. Розкриті крапки вказують на послідовності з глибоководних біосфер.

Повнорозмірне зображення

обговорення

У цьому звіті мікрокосми SIP готували з використанням стерилізованої води з фільтром, а інкубацію припиняли через 5 днів. В результаті експерименту було виявлено, що солоний болотний сирний землетрус гетеротрофний, не поглинаючи 13С з бікарбонату. Деякі кренархічні TRF були виявлені в 13-C-фракції майже з кожного мікросвіту, доповненого органічним 13-C-вуглецем, незалежно від типу субстрату. Це свідчить про те, що ці специфічні кренарії здатні засвоювати широкий спектр органічних субстратів: прості метаболічні проміжні продукти (ацетат), амінокислоти (гліцин), органічні сполуки азоту (сечовина), ліпіди та пігменти та складні суміші біополімерів (ISOGRO). Однак інші кренархеальні TRR були виявлені лише в 13 С-смугах із змінених субстратом мікрокозів (ацетат або сечовина) і можуть мати більш обмежені метаболічні здібності.

Загальна кількість TRF в діапазоні 12 С (лінія) та в діапазоні 13 С (сірі смуги) для піків, що представляють більше 2% профілю спільноти.

Повнорозмірне зображення

За часом інкубації наших експериментів SIP також можна оцінити параметри росту кренархії in situ. Якщо припустити, що для повного маркування ДНК 13 С та виявлення в нашій 100% -поміченій смузі 13 С-носіїв необхідні дві повторювані події, це говорить про те, що сольові сечові кренархеї мають час подвоєння приблизно від 2 до 2,5 днів. Попередні дослідження вимірювали швидкість росту культивованих кренарх з окисленням аміаку (Könneke та співавт., 2005) та/або отриманим часом подвоєння шляхом визначення кількості копій 16S рРНК (Park et al., 2010). Ці звіти показують максимальну швидкість росту окислюючих аміак архей (AOA) у рідкому середовищі при 25-28 ° C від 0,57 до 0,78 на день (або вдвічі між 1,28 і 1,75 дня). Навпаки, наші висновки узгоджуються з попередніми спостереженнями про дещо повільніший темп зростання осаду (0, 2 на день, Mosier et al. (2012)). Однак ці результати можуть бути завищеною оцінкою потенційного темпу зростання, оскільки SIP вимагає, щоб усі попередники для синтезу ДНК були рівномірно позначені 13С для виявлення.

На закінчення сказано, що багато мезотермальних кренархей (Thaumarchaea) у відкладеннях солончаків асимілювали широкий спектр органічних субстратів з 13 С-субстратами, щоб відтворити їх геноми. Інші кренархе були набагато більш селективними в 13 джерелах вуглецю С, що використовуються для росту. Підхід SIP демонструє солончаки, які можуть бути використані для вивчення метаболічних здібностей кренархії та можуть допомогти визначити лабораторні умови для виділення цих гетеротрофних мікроорганізмів. Опинившись у чистій культурі, традиційні мікробіологічні методи можуть бути використані для поліпшення нашого розуміння фізіологічних здібностей кренархеї. Нарешті, експерименти, що безпосередньо пов'язують моделі використання вуглецю з конкретними членами мікробної спільноти, можуть дати уявлення про конкурентні відносини між кренархаями та бактеріями та покращити наше розуміння екології мікробів.