МАЄ ДОКТОРСЬКУ ДИСЕРТАЦІЮ РОЛЬ ПОЛІМЕРАЗИ-1 І 2 ФЕРМЕНТІВ ПОЛІМЕРАЗИ-1 І 2 У РЕГУЛЮВАННІ МЕТАБОЛІЧНИХ ФАКТОРІВ ТРАНСКРІПЦІЇ ПЕТЕР БЕЙ УНІВЕРСИТЕТ ДЕБРЕЦЕНТУ 2013 ФАКУЛЬТЕТ ЗАГАЛЬНОЇ МЕДИЦИНИ.
4.2. Як фермент PARP-2 впливає на функцію метаболічних органів і тканин? 42 4.2.1. Метаболічне фенотипування мишей PARP-2 -/- 42 4.2.2 Вплив делеції PARP-2 на функцію білої жирової тканини 42 4.2.3. Обстеження органів доставки енергії (коричнева жирова тканина, поперечно-поперечно-смугаста мускулатура) 45 4.2.4. Біохімічні зміни в печінці після делеції PARP-2 49 4.2.5. Дослідження реакції мишей PARP-2 -/- на дієту з високим вмістом жиру 50 4.2.6. Дослідження ендокринної функції підшлункової залози у мишей PARP-2 -/- 51 4.3 Чи може видалення PARP-2 забезпечити захист від окисних пошкоджень? 55 5. Обговорення та перспективи 60 5.1. Молекулярний механізм метаболічної ролі PARP-1 та PARP-2 60 5.2. Роль ферментів PARP-1 та PARP-2 у метаболічних тканинах 64 5.3. Наслідки фармакологічного пригнічення PARP 66 5.4. Взаємодія між ферментами PARP та шляхами датчиків енергії 66 5.5 Взаємозв'язок між ферментами PARP та метаболічними захворюваннями 67 5.6. Взаємодія ферментів PARP та ферментів сиртуїну у відповідь на окислювальний стрес 70 5.7 Подальші взаємодії між сиртуїном та ферментами PARP 73 7. Підсумок нових наукових результатів, представлених у дисертації 75 9. Список літератури 81 10. Допоміжні програми 100 4
TBARS Реакційноздатні речовини тіобарбітурової кислоти TFAM мітохондріальний фактор транскрипції A TR рецептор щитовидної залози TropI тип I тропонін TUNEL - Кінцева дезоксинуклеотид трансфераза dutp маркування маркування UCP роз'єднання білка 7
mtsai, 2007); PPARγ троглітазон (TZD, 5 мкм). Ac-Естрадіол (10 мкм) використовували для активації рецептора естрогену β (ERβ). 23
Таблиця 2. Детальна інформація про процедури, що використовуються в аналізах репортерів люциферази Експеримент Конструкції клітинних ліній (назва, кількість) Інкубація Експресія PARP-2 HEK293T 0,6 мкг psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp-2 6 год вплив на трансактивацію PPARα 1 мкг psg -pparα 1 мкг pgl3- (j wt) 3 TKluc 0,4 мкг pcmv-βgal PARP-2 експресія HEK293T 0,6 мкг psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp-2 6 год вплив на трансактивацію PPARγ 1 мкг psg-pparγ 1 мкг pgl3- (j wt) 3 TKluc 0,4 мкг pcmv-βgal Експресія PARP-2 HEK293T 0,6 мкг psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp-2 6 годин вплив на трансактивацію PPARδ 1 мкг psg-pparδ 1 мкг pgl3- (j wt) 3 TKluc 0,4 мкг pcmv-βgal PARP-2 експресія HEK293T 0,6 мкг psuper-siparp-2/psuperscrparp-2/pbabe/pbabe-parp- 2 6 год вплив на трансактивацію ERβ 1 мкг psg- ERβ 1 мкг vitellogenina2-ere-tkluc 0,4 мкг pcmv-βgal PARP-2 експресія HEK293T 1 мкг psuper-shparp-2/psuper- 10 год вплив на промотор SIRT1 scrparp- 2/pbabe/pbabe- PARP-2 1,6 мкг Звіт промоутера SIRT1 er 0,4 мкг pcmv-βgal Вплив експресії PARP-2 на промотор SIRT1 MOVAS 8 мкг репортер промотору SIRT1-91 4 мкг pcmv-βgal 48 год 24
Km SIRT1 (Ame et al., 1999; Houtkooper et al., 2010), отже, малоймовірно, що активація PARP-2 адекватно знижує NAD + субстрат із SIRT1, і тому ми можемо зіткнутися з іншим молекулярним механізмом, ніж ефект видалення PARP-1. У всіх використовуваних моделях спостерігалося збільшення експресії SIRT1 для делеції PARP-2, а PARP-2 був репресором промотору SIRT1. За відсутності статті 61
Показано, що PARP-2 сприяє закриттю структури корматину та появі гетерохроматину. Liang et al. (Liang et al., 2013) показали, що PARP-2 призводить до накопичення гістонових деацетилаз HDAC5 і HDAC7 та гістону метилтрансферази G9a у її репресованих промоторах і створює характер ацетилювання та метилювання, характерний для репресованого хроматину. Ця ж група (Liang et al., 2013) далі показала, що накопичення цих гістономодифікуючих ферментів не залежить від ферментативної активності PARP-2. Я повинен додати, що за відсутності PARP-2 високий ступінь перебудови експресії генів був описаний Farres et al. (Farres et al., 2013). У наших власних експериментах з мікрочипами ми спостерігали зміни в експресії понад 600 генів після виснаження PARP-2. Серед них
Експресія 450 генів при цьому зменшилася
Механізм захисту мітохондрій, подібний до делеції PARP-2. Можливо, це пов’язано з тим, що експресія PARP-1 дуже низька в печінці (
активація та як наслідок зменшення експресії PDX1 (Kitamura et al., 2002). У будь-якому випадку гіпофункція підшлункової залози у мишей PARP-2 -/- є несподіваною, оскільки надмірна експресія SIRT1 посилює секрецію інсуліну в підшлунковій залозі завдяки поліпшенню функції мітохондрій (Bordone et al., 2006; Moynihan et al., 2005). Поясненням розбіжностей може бути те, що результат двох ефектів (інгібування та індукція мітохондріального біогенезу PDX1) диктує поведінку бета-клітин, які в різних моделях присутні у різних пропорціях. Через переважання деацетилювання FOXO1 (і, як наслідок, пригнічення PDX1) через низьку надмірну експресію SIRT1 після делеції PARP-2, інгібування проліферації стає домінуючим. На відміну від цього, у випадку високої надмірної експресії SIRT1 (у двох зазначених дослідженнях
5.7 Додаткові взаємодії між ферментами сиртуїну та PARP. Можна поставити запитання, чи взаємодіють ферменти сиртуїну, крім SIRT1, з PARP-1 або PARP-2. Ми показали, що видалення PARP-1 або введення інгібітора PARP не змінювали активності цитоплазматичного SIRT2 та мітохондріального SIRT3. Ймовірно, змін не спостерігалося, оскільки збільшення рівнів NAD +, спричинене інгібуванням активності PARP-1, було обмежене ядерним відділом NAD + і не впливало на концентрацію NAD + у цитоплазматичних або мітохондріальних компартментах, які вважаються ізольованими. Ефект PARP-2 також був обмежений SIRT1, що можна пояснити специфічністю змін транскрипції. Інші ферменти сімейства PARP також можуть відігравати роль у регуляції метаболізму. Ферменти PARP з відомими метаболічними ролями наведені в таблиці 4. 73
Bai P, Cantó C. Роль ферментів PARP у метаболічній регуляції та захворюваннях. Cell Metab. 16 (5) 290-295. IF: 14 619 Szántó M, Brunyánszki A, Kiss B, Nagy L, Gergely P, Virág L, Bai P (2012) Полі (ADP-рибоза) полімераза-2: нові транскрипційні ролі білка, що відновлює ДНК. Клітинні та молекулярні науки про життя 69 (24): 4079-4092. IF: 5,615 77
Bai P, Hegedűs Cs, Transylvanian K, Szabó E, Bakondi E, Gergely Sz, Szabó Cs, Virág L (2007) Нітрування білка тирозином та активація полі (adp-рибоза) полімерази в обробленому N-метил-N-нітро-нітрозогуанідином тимоцити: наслідки для цитотоксичності. Листи з токсикології 170 (3), 203-213. IF.: 2826 Erdelyi K, Kiss A, Bakondi E, Bai P, Szabo C, Gergely P, Erdodi F, Virag L. (2005) Галлотаннін пригнічує експресію хемокінів та запальних цитокінів у клітинах A549. Молекулярна фармакологія 68 (3), 895-904. ІФ.: 4612 80
Доповіді, обговорені в дисертації