кишечника

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Розпад кофеїну в H. Hampei
  • Біогеографічний аналіз мікробіому Росії H. Hampei
  • Бактерії, які розщеплюють кофеїн в кишечнику H. Hampei
  • Кисневі профілі в кишечнику H. Hampei
  • Повторне встановлення розпаду кофеїну в H. Hampei
  • Обговорення
  • Методи
  • Зразки комах
  • Екстракція ДНК, ампліфікація ПЛР та високопродуктивне секвенування
  • Аналіз гена 16S рРНК
  • Виділення бактерій, що руйнують кофеїн, та їх ідентифікація.
  • Виявлення генів ndmA в ізольованих і H. Hampei
  • O 2 Вимірювання за допомогою мікроелектродів
  • Транзитний час дієти в H. Hampei
  • Лікування та реінфекція антибіотиками.
  • Виявлення кофеїну у зразках фрасу
  • Вплив лікування антибіотиками на розмноження H. Hampei
  • Приєднання
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Відео
  • Додатковий фільм 1
  • Файли Excel
  • Додаткові дані 1
  • Коментарі

Предмети

  • Ентомологія
  • Мікробна екологія
  • Мікробіом

Резюме

Кавовий ягідник (Hypothenemus hampei) є найбільш руйнівним шкідником кави у світі, оскільки його зараження зменшує врожайність на цілих 80%. Кофеїн - це алкалоїд, який може бути токсичним для комах і повинен діяти як захисний механізм, що пригнічує рослиноїдні рослини. Тут ми показуємо, що кофеїн розкладається в кишечнику H. hampei, і що експериментальна інактивація мікробіоти кишечника усуває цю активність. Ми демонструємо, що мікробіота кишечника у зразках H. hampei із семи країн-виробників кави та лабораторно вирощених колоній має ядро ​​мікроорганізмів. У всьому світі всюдисущі члени мікробіоти кишечника, включаючи видатні види Pseudomonas, живуть на кофеїні як на єдиному джерелі вуглецю та азоту. Гени кофеїндеметилази Pseudomonas експресуються in vivo в кишечнику H. hampei, а царювання комах, оброблених антибіотиками ізольованим штамом Pseudomonas, відновлює здатність розкладання кофеїну, підтверджуючи його ключову роль.

Вступ

У комах, як і у інших тварин, розщеплення кофеїну може каталізуватися ферментами цитохрому Р450 20, 21. Однак не повідомлялося, що інші метазоани витримують концентрації кофеїну, яким піддається H. hampei, одночасно існуючи та завершуючи весь свій життєвий цикл виключно на зелених кавових зернах. Ми припускаємо, що розпад кофеїну в H. hampei в основному зумовлений активністю його мікробіоти в кишечнику. Тут ми представляємо перше дослідження мікробіому H. hampei та його ролі у детоксикації кофеїну у комах. Наше відкриття мікробіотичного компонента для перетворення кофеїну та існування H. hampei у кавових зернах має важливе значення для розуміння метаболізму та екології цього важливого шкідника.

Результати

Деградація кофеїну у H. hampei

Щоб перевірити гіпотезу про те, що деградація кофеїну є процесом, опосередкованим мікробами у H. hampei, ми отримали зразки з семи географічно розподілених регіонів вирощування кави: Кенії (Кіамбу), Індонезії (Східна Ява), Індії (Карнатака), Пуерто-Рико (Ад'юнтас ), Гаваях (Кона), Гватемалі (Коатепеке) та Мексиці (Чіапас). Зразки з Індії також включали відібраних комах обох домінуючих видів Coffea (C. arabica та C. canephora). Крім того, ми використовували лабораторно вирощену колонію, спочатку отриману з колумбійської популяції H. hampei та трьох інших видів короїдів, які не можуть існувати на кавових зернах (H. crudiae, H. eruditus та Scolytodes maurus).

Повний розмір таблиці

( до ) Експериментальне проектування та аналіз концентрацій кофеїну в контрольній пробі та зразках H. Hampei, оброблених антибіотиками. Виснаження мікробіому H. Hampei, опосередковане антибіотиками, усуває трансформацію кофеїну та збільшує виведення кофеїну. ( b ) Профілі FTIR для чистого кофеїну (чорний), контрольних екскрементів (комахи, не оброблені антибіотиками, червоний) та екскрементів комах, оброблених антибіотиками (зелений). Представлені профілі представляють середнє значення всіх вимірювань (n = 6).

Повнорозмірне зображення

Біогеографічний аналіз мікробіома H. Hampei

( до ) Філогенетичний аналіз мережі, що показує домінуючі групи бактерій, асоційовані із зразками H. Hampei із семи основних країн-виробників кави. Зразки з Мексики також включали комах, що не належать до H. Hampei. ◊, H. Hampei, - S. maurus; Δ, H. crudiae; □, H. eruditus. ( b ) Частка Pseudomonas spp. послідовності в мікробіомі зібраних зразків.

Повнорозмірне зображення

Бактерії, що руйнують кофеїн, у кишечнику H. Hampei

( до ) Кофеїновий градієнтний планшет із зображенням колоній бактерій, виділених із шлунково-кишкового тракту H. hampei, та їх ідентичність, визначену філогенетичним аналізом. P. fulva була основною групою отриманих ізолятів. ( b ) Філогенетичне дерево для послідовностей альфа-субодиниці кофеїндеметилази (NdmA), отриманих з ізольованих бактерій (жовтий), а також з РНК, вилученої з польових зразків H. hampei (зелений). ( c ) Зразки H. Hampei, попередньо оброблені антибіотиками протягом чотирьох тижнів, інокулювали P. fulva, відновлюючи його здатність розкладати кофеїн, як було продемонстровано за допомогою вимірювань кофеїну FTIR та GC-MS у його мулі (див. Таблицю 1).

Повнорозмірне зображення

Кисневі профілі в кишечнику H. hampei

Градієнти кисню вимірювали в кишечнику H. hampei за допомогою мікроелектродів. Всі вимірювання проводились у передній середній кишці жука (див. Додаткову рисунок 1). Під час цих процедур кінчик електрода відводили на поверхню кишкової стінки і утримували в положенні до тих пір, поки виміряні концентрації O 2 не стабілізувались. У всіх випадках, як тільки наконечник проникав у кишкову стінку, концентрація кисню зменшувалась зі стрімкими градієнтами, які переходили від мікроаерофільних умов до зменшеного анаеробного ядра (рис. 4).

На малюнку показано кисневі профілі трьох кишок жуків. Зверніть увагу на перехід від мікроаерофільної області до анаеробного ядра в просвіті передньої середньої кишки (див. Додаткову рисунок 1).

Повнорозмірне зображення

Відновлення розпаду кофеїну у H. hampei

Лабораторні зразки H. Hampei, які отримували антибіотики, спочатку годували мінімальним раціоном, що містив P. fulva, протягом 1 тижня. Згодом комах переводили на свіжоприготовлену стерильну мінімальну дієту і давали їм годуватися протягом 4 год до того, як було зібрано кількість слабкого та визначено концентрацію кофеїну. Аналізи GC-MS та FTIR показали майже повне виснаження вмісту кофеїну в екскрементах реінфікованих комах (рис. 3в, таблиця 1). Також оцінювали репродуктивну придатність комах, оброблених антибіотиками та інфікованих P. fulva. Комахи не відновили здатність розмножуватися після щеплення P. fulva (додаткова фігура 3).

Обговорення

Хоча іноді повідомляється, що інші комахи харчуються насінням кави 24, H. hampei, це єдина комаха, яка спеціалізується на годівлі та завершенні всього свого життєвого циклу виключно в зернах кави в ягоді 16, 25. Виживаючи в цьому середовищі, H. hampei переживає хронічний вплив кофеїну, який, як відомо, є токсичним алкалоїдом 3, 5, 7, 9, 10, що робить цю комаху привабливою модельною системою для оцінки ролі мікробів у адаптації тварин у незвичне середовище. У цьому дослідженні ми перевірили, чи не відбувається опосередкування деградації кофеїну у H. hampei мікробіотою кишечника комахи.

Члени мікробіоти кишок H. Hampei були ідентифіковані від комах, зібраних із семи країн-виробників кави та однієї лабораторної колонії. Розрахункові аналізи розподілу β-різноманітності та дисперсії показали, що мікробіомний склад H. Hampei був суттєво пов'язаний з географічним походженням кави, а також з видами кави, де вона варіювала (див. Додаткові дані 1). Утворення морфокриптичних одиниць раніше було продемонстровано у зразках H. Hampei, зібраних з різних країн-виробників кави, аналізуючи мікросателітні маркери та послідовності генів COI 30. Ці "видові комплекси", разом з нашими висновками про географічні зміни мікробних спільнот у H. hampei, можуть свідчити про коеволюцію комах та їх мікробіоти. Вміст кофеїну суттєво різниться серед видів кави, що оцінювались 31, і, хоча його тут не тестували, концентрація кофеїну може бути ще одним важливим фактором, що впливає на склад кишкового мікробіома кишки H. hampei.

Тут ми показуємо, що H. Hampei, найбільш руйнівний шкідник кави в країнах-виробниках кави, має спільне ядро ​​мікробіоти кишечника, яке розподіляється між людьми з різних географічних розташувань, і що багато з цих організмів можуть існувати лише на основі кофеїну. вуглецю та азоту. Ми також показуємо, що мікробіота H. Hampei відповідає за розпад кофеїну в шлунково-кишковому тракті комах. Мікробні спільноти відіграють важливу роль у всіх екосистемах - від участі в кругообігу поживних речовин у ґрунті до конфігурації імунної системи у людей 35, 36, 37. Наша демонстрація ролі мікробіоти кишечника у детоксикації кофеїну у H. hampei має важливе значення для розуміння метаболізму та екології цього важливого шкідника кави. Це також забезпечує нові шляхи для розробки стратегій біоконтролю, де мікробіом представляє нову мішень завдяки ролі асоційованих мікроорганізмів у підвищеній здатності хазяїна виживати та домінувати у ворожому середовищі.

Методи

Зразки комах

Зразки H. hampei (n = 68; Додаткові дані 1) були отримані з Кенії (Кіамбу), Індонезії (Східна Ява), Індії (Карнатака), Пуерто-Рико (Ад'юнтас), Гаваїв (Кона), Гватемали (Коатепеке) та Мексики (Чіапас; Додаткові дані 1). Комах з Індії збирали з C. arabica та міцного гібрида (C. congensis × C. canephora). H. obscurus, H. crudiae та S. maurus були отримані із стебла листя Cecropia в Чіапасі, Мексика. Для біогеографічного вивчення та порівняння також були включені кавові ягоди, вирощені на штучній дієті 38 (лабораторні комахи). На всіх місцях збору окремих комах поміщали живими в пробірки, що містять RNAlater (Ambion, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), і відправляли в нашу лабораторію для аналізу.

Екстракція ДНК, ампліфікація ПЛР та високопродуктивне секвенування

Аналіз гена 16S рРНК

Виділення бактерій, що руйнують кофеїн, та їх ідентифікація.

Виявлення гена ndmA в ізолятах та H. hampei

O 2 Вимірювання за допомогою мікроелектродів

Час дієтичного транзиту в H. Hampei

Лікування та реінфекція антибіотиками.

Виявлення кофеїну у зразках фрасу

Для визначення концентрації кофеїну у зразках фрасу з антибіотиками, заражених антибіотиками та контрольних жуків, було дотримано дві стратегії: вимірювання кофеїну в сирому фрасі за допомогою FTIR та вимірювання кофеїну, вилученого із зразків фрасу з GC-MS .

Для аналізів FTIR та GC-MS були визначені суттєві відмінності між лікуваннями (контроль, лікування антибіотиками та лікування антибіотиками/повторне посів) за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та менш значущих відмінностей із використанням програмного середовища R 53 .

Вплив лікування антибіотиками на розмноження H. hampei

Нещодавно з’явилися сотня самок, коли дорослих поміщали разом з 20 самцями у флакони, що містять звичайну дієту, та інкубували протягом 14 днів для максимального спарювання. Після первинної інкубації спаровування окремих самок переводили у флакон, що містив звичайну дієту (контроль) або дієту з доповненням антибіотиками (як описано вище), та інкубували протягом 44 днів. Третю групу злучених самок лікували антибіотиками протягом 3 тижнів, переводили на дієту з P. fulva і також інкубували протягом 44 днів. Деструктивні зразки відбирали з п’ятнадцяти флаконів кожної обробки під час кожного відбору проб (дні 14, 24, 34 та 44) та аналізували яйця, личинки, лялечки та дорослі особини. Логістичну регресію проводили на сумі всіх етапів у кожному флаконі. Потім модель була оснащена лише основними ефектами (ДІЄТА: контроль, антибіотики, інфекція; та ЗРАЗОК: час відбору проб), де було враховано надмірне розсіювання. Обидва основні ефекти були значущими, тобто є значний ефект дієти порівняно з контролем, і є значний ефект вибірки (наступні зразки мали більший показник).