предметів
реферат
Метою цього дослідження було визначити взаємозв'язок доза-відповідь щодо смертності та деформації на ранніх етапах життя даніо після мікроін'єкції ембріонів із градуйованою дозою SeMet та дослідити потенційні основні механізми токсичності розвитку, спричиненої Se. Використання даніо-риби має багато переваг для токсикології розвитку та маніпуляцій з ембріонами. Рибки даніо дають прозорі та не приклеюються ембріони, які допомагають у успішному мікроін’єкції хімічних речовин 26, 27, 28. З огляду на широку інформацію про біологію розвитку та геном даніо, токсикологічні дослідження щодо розвитку можна легко провести на цьому виді риб 27, 28 .
результат
Концентрації селену
Виміряні та номінальні концентрації Se були прямо пропорційні кожній групі лікування. Виміряні концентрації Se у контрольній, 8, 16 або 32 мкг Se/g сухої маси (дм) мікроін'єктованих груп становили 1,6 ± 0, 1, 11, 0 ± 0, 6, 18, 7 ± 1, 0 та 29,3. 0,5 мкг Se/г дм відповідно. Значно вищі концентрації Se спостерігали в яйцях, мікроін'єкційних 8, 16 або 32 мкг Se/g дм, порівняно з яйцями, мікроін'єкційними безсироватковим розчином Даніо (контроль) (p 
* Значна різниця порівняно з контрольною групою з використанням одностороннього ANOVA з подальшим тестом Даннета (с
* Значуща різниця порівняно з контрольною групою з використанням одностороннього ANOVA з подальшим тестом Даннета (с
Фото A показує нормальну (контрольну) рибу, B показує кіфоз та лордоз, C. показує набряки, D показує сколіоз, Е показує деформації плавників і F є личинковою рибою з множинними деформаціями та набряком перикарда.
Повнорозмірне зображення
Ефекти впливу антиоксидантних реакцій
Виявлено надлишки транскриптів nrf2a та nrf2b, глутатіонпероксидази 1a (gpx1a), глутатіон S-трансферази pi 1 і 2 (gstp1 і gstp2), рецептора арильних вуглеводнів 2 (ahr2) та білкової тирозинфосфатази 1b (ptp1b) при 48, ptp1b та 72 годин після запліднення (hpf) у личинок даніо з контрольної та 10 мкг мікроін’єкційних груп Se/g дм. Посилення регуляції nrf2a та nrf2b спостерігалось при 72 і 96 hpf у даніо з групи, яка зазнала впливу SeMet, порівняно з контрольною групою (рис. 4A, B). Значно більша регуляція надлишкової транскрипції nrf2a спостерігалась при 96 hpf, тоді як кількість транскриптів nrf2b була значно збільшена як при 72, так і при 96 hpf (p
Надлишок стенограми фактора 2a (nrf2a), ( B ) nrf2b, ( C. ) глутатіон S-трансфераза pi1 (gstp1), ( D ) gstp2, ( Е ) рецептор арильних вуглеводнів 2 (ahr2), ( B ) nrf2b, ( C. ) gstp2, ( Е ) рецептор арильних вуглеводнів 2 (ahr2)) і ( F ) білка тирозинфосфатази 1B (ptp1b) у даніо, що піддається дії 10 мкг Se/г дм у формі селенометионіну або контрольного розчину (Danieau) за допомогою мікроін’єкції ембріона. Надлишок транскрипту визначали за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі 48, 72 та 96 годин після запліднення (hpf). * Значно відрізняється від контрольної групи за допомогою t-критерію студента (с
Надлишок стенограми ( A ) метіонін аденозилтрансфераза 1a (mat1a); a ( B ) mat2ab у даніо, підданих дії 10 мкг Se/г дм у формі селенометионіну або контрольного розчину (Danieau) за допомогою мікроін’єкції ембріона. Надлишок транскрипту визначали за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі 48, 72 та 96 годин після запліднення (hpf). * Суттєво відрізняється від контрольної групи за допомогою t-тесту Стьюдента (с 2, 3, 29. Поточне дослідження мікроін’єкцій SeMet проводилось для імітації материнської експозиції Se та використовувалось для дослідження механізмів Se-індукованої токсичності на ранніх термінах У цьому дослідженні на ранніх стадіях спостерігалося значне зменшення інкубаторії ембріонів, дозозалежне збільшення смертності та деформацій, а також зміна великої кількості транскриптів nrf2a, nrf2b, gstp2, ahr2, ptp1b, mat1a та mat2ab. життя. були екологічно важливими в цьому дослідженні, і такі концентрації реєструвались у яйцях риб, зібраних з водних екосистем, заражених Se. 11, 29, 29, 30 .
Існує баланс між діяльністю білкових тирозинкіназ (РТК) та білкових тирозинфосфатаз (ПТФ) у клітинах, які відіграють ключову роль у сигналізації клітин та розвитку тварин 42, 43, 44. Встановлено, що окислювальний стрес та вплив хімічних речовин, включаючи SeMet, інгібують кількість транскриптів та/або активність білка тирозинфосфатази 1B in vitro та in vivo 25, 42, 45, 46. Попередні дослідження продемонстрували роль ptp1b у адгезії клітинних клітин, ангіогенезі, апоптозі та міграції клітин 43, 47, 48, критичних процесах у розвитку ембріонів хребетних. Тому ми вивчили кількість транскриптів ptp1b на ранніх стадіях життя даніо після розвитку впливу надлишку SeMet шляхом мікроін'єкції яєць та спостерігали, що SeMet спричиняв значно регульоване зниження рівня транскрипту ptp1b при 48 hpf. Цей висновок свідчить про те, що модифікація активності білкової тирозинфосфатази також може бути пов’язана з індукованою сироваткою крові токсичністю розвитку у даніо.
На закінчення, наші результати свідчать про те, що зберігання більш високих концентрацій вільної форми SeMet в яйцях переважно спричинює смертність, а не деформацію на ранніх стадіях життя риб. Експозиція надлишку SeMet у процесі розвитку шляхом мікроін’єкції ембріонів змінила експресію генів факторів транскрипції, що реагують на окислювач, nrf2a та nrf2b, а також gstp1, gstp2, ptplb, ahr2, matla та mat2ab. Ці результати вказують на те, що токсичність для розвитку, яка перевищує дані SeMet, може бути обумовлена окислювальним стресом або порушенням метилювання або комбінацією цих механізмів. Нарешті, наше дослідження показує, що методи мікроін’єкції ембріонів можуть бути успішно використані для дослідження механізмів токсичності тератогенних хімічних речовин на ранніх етапах життя даніо.
методи
Випробувана сполука
Селено-L-метіонін був придбаний у Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Канада). Чистота сполуки була більше 98%.
Піддослідна тварина
Усі процедури утримання риб та експериментальні процедури, прийняті в цьому дослідженні, були схвалені Етичною радою з досліджень тварин в Університеті Саскачевана (Протокол № 20030076) та дотримувались вказівок Канадської ради з догляду за тваринами для використання людьми у тварин. . Дорослу особину даниси дикого типу (штам AB; віком приблизно 4-5 місяців) придбали у місцевого постачальника і помістили в температурну камеру з контролем навколишнього середовища (28,0 ± 1,0 ° C) та фотоперіод (світло протягом 14 годин і 10 годин темряви ).). Середня маса вологого тіла риби становила 0,366 ± 0,019 г. Дорослі риби були акліматизовані до лабораторних умов за 4 тижні до розведення. Протягом періоду акліматизації риб годували кормом для пластівців Nutrafin® (Hagen Inc., Монреаль, QC, Канада) та очищеними хіромами (Bio-Pure Blood Worms, Hikari Sales Inc., Hayward, CA, USA).
мікроін’єкції
Крім того, була спричинена концентрація Se яйця, що спричинило 20% смертності (
10 мкг Se/г дм), і цю дозу вводили в жовток, щоб визначити кількість чутливих до окислювача мРНК генів (nrf2a, nrf2b, gpx1a, gstp1 та gstp2). ), ферменти, що беруть участь в катаболізмі метіоніну (mat1a, mat2a, mat2aa і mat2ab), ahr2 і ptp1b при 48, 72 і 96 к.с.
Деформаційний аналіз
Загальний аналіз штаму проводили на 6 dpf личинок даніо. Детальна процедура аналізу деформацій була пояснена раніше. Коротко кажучи, личинки даніо були евтаназовані передозуванням буферизованого трикаїнметансульфонату (MS-222) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Канада) і консервували у 10% забуференному формаліні протягом 12 годин, перш ніж переносити їх у 70% етанол. Кожну личинку личинок досліджували на предмет деформації скелета, черепно-лицевої та реберної тканин та набряків, використовуючи модель розсікаючого мікроскопа Olympus SZ-CTV (Olympus, Melville, NY, USA), і для кожної риби реєстрували наявність або відсутність відхилень у розвитку. Загальний відсоток деформацій обчислювали діленням кількості неправильно сформованих личинок на загальну кількість личинок і множенням на 100.
Кількісне визначення селену
Загальні концентрації Se у збірних зразках яєць вимірювали за допомогою мас-спектрометрії з індуктивно зв'язаною плазмою (ICP-MS) в Центрі токсикології (Університет Саскачевана, Саскатун, Південна Кароліна, Канада). З кожної обробленої групи для кількісної оцінки Se було зібрано n = 3 - 4 повторності 45 - 50 об'єднаних яєць. Детальна процедура аналізу Se була описана раніше 3, 59. Межу кількісного визначення (LOQ) 0,13 мкг Se/g визначали, використовуючи пробіли методу. Концентрації Se в яйцях вимірювали на вологій основі і переводили на суху масу на основі вмісту вологи 92,5%, визначеного в підгрупі яєць зебри.
Ланцюгова реакція в реальному часі (Q-PCR)
Експресія MRNA для генів, що кодують ферменти або фактори транскрипції, що представляють інтерес, була визначена кількісно за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції (Q-PCR). Загальну РНК витягували з n = 3-5 повторностей 20 ембріонів та/або личинок даніо з кожної групи лікування, використовуючи міні-комплект RNeasy Lipid Tissue Mini (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) відповідно до інструкцій виробника. Очищену загальну РНК кількісно визначали за допомогою спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Набір зворотної транскрипції QuantiTect® (Qiagen) використовували для синтезу кДНК з 1 мкг загальної РНК. Детальні процедури вилучення РНК та синтезу кДНК були пояснені в іншому місці 25 .
Кількісну ПЛР у реальному часі проводили на 96-лункових ПЛР-планшетах із використанням системи ПЛР ABI 7300 у реальному часі (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США). Генспецифічні праймери були розроблені проти генів-мішеней за допомогою програмного забезпечення Primer 3 і були показані послідовності праймерів (Таблиця 2). Детальні процедури Q-PCR були пояснені в іншому місці 25. Виникнення гена-транскрипту було кількісно визначено шляхом нормалізації до експресії фактора подовження 1a (ef1α) за методом MNE (Середнє нормалізоване середнє вираження) за Саймоном (2003) 60 .
Стіл в натуральну величину
Статистичний аналіз
Всі статистичні аналізи проводили за допомогою Sigmaplot 11 (Systat Software Inc., Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Дані перевіряли на нормальність за допомогою критерію Шапіро-Вілька та на однорідність розсіювання за допомогою критерію Левена. Дані, які не відповідали вимогам до параметричних статистичних процедур, були перетворені в журнал 10. Нетрансформовані дані показані на всіх рисунках. Суттєві відмінності у загальних концентраціях Se у яйцях, інкубаторії ембріонів та смертності та загальних деформаціях данилових риб даніо у контрольних та класифікованих груп мікроін’єкцій SeMet були перевірені одностороннім ANOVA з подальшим тестом Даннета. Надлишки транскриптів генів антиоксидантів, метилювання, AhR та білкової фосфатази, пов’язаних з активністю даніо з контрольної групи, та груп по 10 мкг, яким вводили Se/g dm при 48, 72 та 96 к.с., перевіряли за допомогою t-критерію студента. Дані виражали як середнє значення ± SEM Різниці вважали статистично значущими при p