реферат

Хоча поточна терапія може бути ефективною спочатку, багато пухлин з часом стають хіміорезистентними, що призводить до невдалого лікування. Як результат, залишається нагальна потреба у нових терапевтичних підходах до лікування раку яєчників.

Візуалізація та терапія захворювань щитовидної залози можливі завдяки здатності щитовидної залози накопичувати йодид. Це опосередковано символом йодиду натрію (NIS), трансмембранного глікопротеїну, експресованого на базолатеральній мембрані фолікулярних клітин щитовидної залози. Недавні розробки в генній терапії призвели до багатьох досліджень, спрямованих на впровадження експресії NIS в інших типах пухлин для забезпечення візуалізації та терапії радіойодом. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 Можливість введення експресії NIS у пухлини яєчників була б дуже корисною. Поряд із широко відомими послугами терапії радіойодидами щитовидної залози, NIS пропонує велику перевагу як терапевтичний ген, оскільки забезпечує візуалізацію для підтвердження цільової експресії білка перед продовженням терапії. Крім того, побічний ефект, пов'язаний із застосуванням 131 I, означає, що не всі клітини-мішені повинні експресувати NIS для досягнення повного терапевтичного ефекту. 12

У минулому ми описували успішне використання промотору MUC1 для стимулювання експресії NIS для візуалізації радіойодидів та терапії клітин раку молочної залози. Також повідомлялося про надмірну експресію MUC1 у більшості пухлин яєчників, 18, 19, 20, 21, і, отже, ця конструкція має потенціал для застосування в цій моделі пухлини. Це дослідження описує введення експресії NIS в клітини пухлини яєчників як in vitro, так і in vivo, після чого проводять візуалізацію 123 I та терапію 131 I.

Пухлини яєчників представляють ще одну проблему для опосередкованої вірусом генної терапії, оскільки було показано, що вони виражають мінливі рівні молекул, необхідних для аденовірусної інфекції, такі як рецептор коксакі та аденовірусний рецептор (CAR) та інтегрини. Тому дві аденовірусні конструкції, що містять NIS під контролем (1) цитомегаловірусу (CMV) або (2) промоторів MUC1, використовувались для зараження клітинної лінії раку яєчників (OVCAR-3), яка, як повідомлялося, виражала помірний рівень CAR. Потужний неспецифічний промотор CMV спочатку використовувався для визначення того, чи можна визначити функціональну експресію NIS у цій моделі in vivo. Після успішного лікування CMV/NIS-трансдукованих пухлин, конструкцію MUC1/NIS використовували для забезпечення транскрипційного націлювання на MUC1-позитивні пухлини та подальшого зниження ризику екстратуморальної токсичності. Це дослідження представляє перспективний перший крок, що вивчає потенціал візуалізації радіойодного йоду, опосередкованого НІС, та лікування пухлин яєчників.

результат

125 I дослідження поглинання

Здатність клітин OVCAR-3 поглинати йодид у різні моменти часу після зараження Ad/CMV/NIS або Ad/MUC1/NIS досліджували in vitro (рис. 1). Оптимальне поглинання йодиду спостерігалося через 3 дні після зараження, із 12-кратним збільшенням над клітинами, трансдурованими CMV/NIS (4226 ± 169 cpm), порівняно з контрольними клітинами, порівняно з 5,5-кратним збільшенням клітин, трансдурованих MUC1/NIS (1898). . ± 23 cpm). У всіх випадках поглинання йоду блокувалось у присутності KCLO4, відомого інгібітора функції NIS.

натрієво-йодисто-опосередкована

Поглинання йоду в клітинах OVCAR-3 у різні моменти часу після зараження аденовірусом, що містить NIS, під контролем промоторів CMV або MUC1 (множинність інфекції (MOI) 80). Оптимальне засвоєння йодиду обома конструкціями спостерігалося через 3 дні після вірусної інфекції. Поглинання йоду блокувалось у присутності KClO 4, відомого інгібітора функції NIS.

Повнорозмірне зображення

Вестерн-блот

Мембранні білкові екстракти (10 мкг) з трансдукованих NIS клітин карциноми яєчників (OVCAR-3) піддавали Вестерн-блоттингу мишачим моноклональним антитілом проти амінокислот 468 до 643 білка NIS людини (рис. 2). Мембранні екстракти з клітин, інфікованих CMV/NIS (рис. 2а (ii)) та MUC1/NIS (рис. 2b (ii)), були позитивними на білок NIS при очікуваному розмірі -75-100 кДа. Розмір білка NIS залежить від стану глікозилювання та може коливатися від 50 до 110 кДа, причому 50 кДа являє собою неглікозильований білок. Рівень імунореактивності, виявлений у трансмусованих CMV/NIS клітинах, був сильнішим, ніж рівень, який спостерігався, коли NIS знаходився під контролем промотора MUC1, хоча ця клітинна лінія виражає високий рівень білка MUC1. У клітинах, інфікованих контрольним вірусом, не виявлено білка NIS (рис. 2а (i) та b (i)), хоча спостерігались деякі слабкі неспецифічні смуги.

Вестерн-блот-аналіз експресії NIS у клітинах OVCAR-3 після зараження. ( a ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/CMV/NIS. ( b ) (i) Ad5/NIS, (ii) Ad5/MUC1/NIS. Мембранні екстракти з клітин OVCAR-3, інфікованих Ad5/CMV/NIS ( a (ii)) та Ad5/MUC1/NIS ( b (ii)) показав сильну імунореактивність проти мишачого анти-NIS антитіла, виявляючи білок a 75–100 кДа. В обох випадках експресія NIS не виявлена ​​в мембранних екстрактах клітин, трансфікованих контрольним вірусом ( a (i), b (i)).

Повнорозмірне зображення

імуногістохімія

Трансдуровані NIS клітини OVCAR-3 фіксували в метанолі та піддавали імуногістохімічному фарбуванню для визначення розташування білка NIS у клітині (рис. 3). Інфіковані NIS клітини під контролем промоторів CMV (рис. 3b) або MUC1 (рис. 3c) також були позитивними щодо мембранно-орієнтованого цитоплазматичного білка NIS. Щоб білок NIS функціонував, він повинен бути спрямований на клітинну мембрану. Перебуваючи під контролем промотору CMV, NIS, мабуть, покращує мембранне націлювання, що корелює зі збільшенням рівня поглинання йодиду, що спостерігається на малюнку 1. Клітини, інфіковані вірусом без промотору, були негативними щодо імунореактивності NIS (рис. 3а).

Імуногістохімічний аналіз експресії NIS в клітинах OVCAR-3 після зараження ( a ) контроль вірусу, ( b ) Ad5-CMV-NIS або ( c ) Ad5-MUC1-NIS. У клітинах, трансдурованих NIS, була виявлена ​​імунореактивність як до мембранної, так і до цитоплазматичної імунореактивності NIS. Інфіковані вірусом клітини без промотору ( a ) були негативними щодо імунореактивності NIS.

Повнорозмірне зображення

In vivo 123 I візуалізація

Візуалізація пухлин OVCAR-3 у трьох мишей in vivo за допомогою гамма-камери після введення 0,5 mCi 123 I. За 3 дні до введення йодиду мишам вводили внутрішньопухлинні ін’єкції Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS або вірусу контролю. Всі три зображення показують всмоктування йодиду в щитовидній залозі та шлунку, які виражають НІС, а також у сечовому міхурі, де йодид виділяється із сечею. Фото ( a ) також демонструє чітке зображення пухлини, інфікованої Ad/CMV/NIS на лівому фланзі, з менш інтенсивним зображенням пухлини, очевидним у тварини, якій вводили конструкцію MUC1/NIS ( b ). На панелі ( c ), де пухлина лівого боку заражена контрольним вірусом, зображення пухлини відсутнє.

Повнорозмірне зображення

131 I терапія

Миші отримали внутрішньопухлинну ін'єкцію 5 х 108 PFU Ad/CMV/NIS, Ad/MUC1/NIS або Ad/CMV, через 3 дні внутрішньочеревну дозу або 3mCi 131I, або фізіологічний розчин. Потім розмір пухлини (Д × Ш × В × 0,51) вимірювали щотижня за допомогою штангенциркулів (Рисунок 5).

Терапія радіойодом in vivo ксенографів пухлини яєчників OVCAR-3. Пухлини інфікували Ad5/CMV/NIS, Ad5/MUC1/NIS або контрольним вірусом (пунктирна лінія) з подальшою внутрішньочеревною дозою 131 л або фізіологічним розчином. Статистичний аналіз проводили за допомогою t-критерію Стьюдента, при цьому P = 0,05 вважали статистично значущим. Ad5/CMV/NIS + 131 I проти Ad/CMV/NIS– 131 I, P 131 I порівняно з Ad5/CMV (без NIS) + 131 I, P 131 I, поступово зменшуючись у розмірі до 131 I, різко збільшуючись до середнього об'єм 268 ± 35 та 332 ± 154% від базового обсягу (P 15, 28 - перше дослідження, яке повідомляло про опосередковану NIS терапію 131 I пухлин яєчників на тваринній моделі.

Незважаючи на те, що ці попередні результати є дещо перспективними для використання NIS-опосередкованої терапії пухлин яєчників, відсутність специфічності, наданої промотором CMV, може бути проблематичною. Більшість раків яєчників виявляються лише після метастазування, і тому складаються з кількох розповсюджених пухлин, часто приурочених до порожнини очеревини. Отже, внутрішньочеревне введення вірусу є привабливим шляхом для лікування цієї хвороби з метою посилення взаємодії вірус/клітина пухлини, що, однак, викликає занепокоєння щодо селективності. Неінвазивна радіойодидна візуалізація може бути виконана для підтвердження правильної локалізації НІС перед продовженням терапії. Однак транскрипційне націлювання експресії NIS може потенційно збільшити дозу вірусу до клітин-мішеней та уникнути токсичності для печінки та нормальних мезотеліальних клітин.

Нещодавно ми описали повну регресію пухлини після лікування ксенотрансплантатів раку молочної залози Ad5/MUC1/NIS у мишей. Також повідомляється, що переважна більшість пухлин яєчників надмірно експресує MUC1, 18, 19, 20, 21, тоді як нормальні мезотеліальні клітини слабо виражені або взагалі не експресуються. 29 Після успіху конструкції CMV/NIS ми використовували Ad/MUC1/NIS, щоб забезпечити транскрипційне націлювання на пухлини та мінімізувати потенційний вплив на оточуючі нормальні клітини. У цій моделі, незважаючи на той факт, що клітини OVCAR-3 експресують стійкий білок MUC1, 18 рівнів експресії NIS були недостатньо високими, щоб викликати регресію пухлини після терапії 131 I. Це може бути пов'язано зі зниженою ефективністю зараження порівняно з молочною залозою модель раку. Зображення 123I показало обмежене поглинання йодиду в місці пухлини. Однак у 8-тижневий час обсяг пухлини був значно меншим після MUC1/NIS-інфекції та терапії 131 I порівняно з контрольними пухлинами. Це свідчить про те, що з поліпшеннями, що призводять до вищих рівнів експресії, це може бути життєздатним підходом для цієї моделі пухлини.

Успіх опосередкованого аденовірусом перенесення генів залежить від ефективної трансдукції in vivo. Включення підсилювального елемента перед промотором MUC1 може підвищити рівень отриманої експресії NIS, але не перевищує неоптимальних показників трансдукції пухлини. Багато груп продемонстрували покращене зараження яєчників моделями, що руйнують CAR, яєчники, використовуючи CAR-незалежні або незалежні від тропізму аденовірусні конструкції для обходу печінки та націлення на певні типи клітин, які зазвичай не стійкі до аденовірусної інфекції. 32, 33, 34, 35. Це може збільшити вірусне навантаження на ділянку пухлини і дозволити використовувати менші вірусні дози, потенційно знижуючи імунну відповідь після введення вірусу.

Представлені тут багатообіцяючі попередні результати показують радіойодидну візуалізацію та терапію пухлин яєчників у поєднанні з утворенням модифікованих аденовірусних векторів, вказуючи на потенціал опосередкованої NIS терапії як нового підходу до лікування раку яєчників.

Матеріали і методи

Культура клітин

Клітинна лінія карциноми яєчників OVCAR-3 підтримувалась у середовищі RPMI, доповненій 10% фетальної бичачої сироватки та пеніциліну G (2 од/мл)/стрептоміцину сульфату (100 мг/мл). Клітини підтримували при 37 ° C, 5% CO 2 із середовищем змінювали двічі на тиждень і проходження кожні 7 днів.

Виробництво аденовірусу

У співпраці з ViraQuest Inc. була підготовлена ​​конструкція рекомбінантного аденовірусу аденовірусу серотипу 5 із недостатньою реплікацією, що містить людський NIS під контролем промотору MUC1 (від -1401 до +33). (North Liberty, IA, USA), як описано вище. Коротко кажучи, вставку MUC1/NIS клонували у вектор плазміди VQ/5k, наданий ViraQuest, а потім трансфікували в 293 клітини, що містять аденовірусну ДНК, попередньо обмежену для видалення частини області E1. Після очищення нальоту рекомбінантний аденовірус Ad/MUC1/NIS розширювали в 293 клітинах і очищали шляхом виділення смуг на градієнтах щільності CsCl з подальшим діалізом. Ще один аденовірус із дефіцитом реплікації, що містить NIS, під контролем неспецифічного промотору CMV, був на складі з попередніх експериментів і генерувався за допомогою тієї ж методики. 16

Аденовірусна інфекція клітин OVCAR-3

Клітини висівали в 12-лункові планшети за день до зараження при щільності висіву 1,5 х 105 клітин/лунку для досягнення ∼ 60% злиття інфекції. Потім клітини промивали та інкубували в безсироватковому середовищі, і до кожної лунки додавали різну кількість вірусу. Після 3 годин інкубації при 37 ° С клітини промивали та інкубували у повному середовищі протягом 72 годин перед аналізом експресії/функції NIS. Усі аденовірусні інфекції мали місце принаймні в трьох примірниках.

125 I дослідження поглинання

Здатність клітин концентрувати йодид визначали, як описано у Weiss et al. Коротко кажучи, після трансфекції клітини інкубували у HBSS, що містив 10 мМ HEPES, 10 мкМ NaI та 0,1 мкКі Na125I/мл, рН 7, 3 та 10 мкМ KClO 4, конкурентний інгібітор поглинання йодиду NIS, був включений у контрольні лунки. Після 45-хвилинної інкубації при 37 ° С клітини промивали крижаним сольовим розчином, забуференним фосфатом (PBS), лізували 1 М NaOH і концентрований йодид вимірювали на γ-колекторі.

Екстракція мембрани

Мембранні білки екстрагували із заражених клітин за допомогою описаної вище процедури. Коротко, клітини промивали і ресуспендували в буфері А (250 мМ сахарози, 10 мМ HEPES (рН 7,5), 1 мМ ЕДТА, 10 мкг/мл лейпептину, 2 мкг/мл апротиніну, 1 мМ PMSF). а потім заморожували протягом ночі при -20 ° C. Суспензію клітин потім розморожували і центрифугували при 500 g протягом 15 хвилин при 4 ° C. Додавали 1 мл 1 M Na 2 CO 3 на мл супернатанту з наступним струшуванням при 4 ° С протягом 45 хвилин, потім центрифугували при 100000 g протягом 15 хвилин і гранулу ресуспендували в буфері В (250 мМ сахарози, 10 мМ HEPES (рН 7,5), 1 мМ MgCl 2). Вміст білка визначали за допомогою білкового аналізу BioRad DC (Геркулес, Каліфорнія, США).

Вестерн-блот-аналіз

Для аналізу вестерн-блот використовували систему електрофорезу NuPAGE (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Мембранний білок з клітинних ліній (10 мкг) зменшували в DTT (0,5 М) протягом 10 хвилин при 70 ° C. Зразки потім пропускали на 4-12% -ному збірному поліакриламідному гелі NuPAGE Bis-Tris протягом 1 години при 200 В. Аликвоти норм молекулярної маси білка проводили одночасно на кожному гелі для порівняння розміру зразка. Електроблотінг проводили протягом 1 години при 25 В для перенесення зразків білка на нітроцелюлозну мембрану. Для запобігання неспецифічного зв’язування мембрани інкубували в 5% молоці в TBS-T (20 мМ Тріс, 137 мМ NaCl, 0,1% Твін 20) протягом 1 години з подальшим промиванням у TBS-T. Мембрани інкубували в мишачих моноклональних антитілах (1: 20 000 в 0,1% молока), спрямованих проти людського білка NIS (aa 468-643) 38, протягом 1,5 годин і промивали TBS-T. Потім до мембран протягом 1,5 годин додавали козяче антиміша антитіло з міченою пероксидазою хрону (1: 10000). Після етапів промивання на мембрани на 1 хвилину наносили реагенти ECL Western Blotting Detection Detents (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Потім плівки Kodak BIOMAX MR виставляли на мембрани приблизно протягом 2 хвилин.

Імуногістохімічний аналіз

Клітини розміщували у двокамерних предметних стеклах із щільністю інокуляції 1,5 х 10 5/лунку перед зараженням та імуногістохімією. Слайди поміщали на лід на 15 хвилин, а потім клітини фіксували в холодному метанолі при -20 ° С на 15 хвилин. Після видалення метанолу клітини інкубували у 10% нормальній козячій сироватці (NGS), розведеній у PBS/0,05% Tween 20 (PBS-T), протягом 30 хвилин, щоб блокувати неспецифічне зв’язування. Потім мишаче моноклональне антитіло (1: 2000), спрямоване проти білка NIS людини (aa 468-643) 38, потім застосовували протягом 60 хвилин з подальшим промиванням у PBS-T. Потім клітини інкубували з біотинільованим козячим проти мишачим імуноглобуліном (1: 200) протягом 20 хвилин. Клітини промивали, а потім на 20 хвилин застосовували кон’югований з пероксидазою стрептавідин (1: 300). Після промивання виявлення проводили за допомогою набору пероксидазного субстрату, що містить хромоген діамінобензидин (DAB) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Клітини були забарвлені малахітовим зеленим протягом 5 хвилин перед покриттям монтажним середовищем Dako® Glycergel (Carpintoria, CA, USA).

Зростання ксенотрансплантатів яєчників у мишей

Оголеним мишам-атимікам (Harlan Sprague - Dawley, Indianapolis, IN, USA) було проведено підшкірну ін'єкцію 1 х 10 6 клітин OVCAR-3, суспендованих у 0,2 мл середовища RPMI на одній або обох сторонах. Коли пухлини досягнуть відповідного обсягу (

100 мм 3), мишей садили на дієту з низьким вмістом йоду з водою, доповненою Т4 (5 мг/л), щоб зменшити споживання йоду в щитовидній залозі. Усі експерименти були схвалені та проведені відповідно до рекомендацій клініки Мейо (Рочестер, Міннесота, США).

Аденовірусна інфекція пухлинних ксенотрансплантатів

Мишам з пухлинами ⩾ 100 мм 3, яким утримували дієту з низьким вмістом йоду, вводили внутрішньоорально 5 х 10 8 ПФУ рекомбінантного Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS або вірусу контролю в загальному обсязі 100 мкл 3% сахарози/PBS. Пухлини вводили в різні ділянки для збільшення дисперсії вірусу за допомогою інсулінових шприців. При необхідності пухлину аспірували для видалення асцитичної рідини перед ін’єкцією вірусу.

Зображення пухлини in vivo

Через 3 дні після ін’єкції вірусу в пухлини OVCAR-3 мишам внутрішньочеревно вводили 0,5 mCi 123I та зображували на гальмівній камері з низьким енергоспоживанням коліматора. Серійні зображення отримували в різні моменти часу від 1 до 48 годин після введення йодиду.

131 I терапія

Мишей групували відповідно до розміру пухлини OVCAR-3 та внутрішньопухлинних ін'єкцій Ad5-CMV-NIS, Ad5-MUC1-NIS або вірусу контролю, як описано вище. Через 3 дні після введення вірусу мишам вводили внутрішньочеревно або 3 mCi 131 I, або фізіологічний розчин (контрольна група). Обсяг NIS-трансдукованих та контрольних пухлин контролювали та порівнювали щотижня після введення йодиду як у групах 131 I, так і у фізіологічному розчині. Статистичний аналіз проводили за допомогою t-критерію Стьюдента (неспарений). Статистична значимість була вказана за допомогою значення P P 0,05.

скорочення

Дякую

Основним джерелом фінансування цієї роботи був Фонд Проспект-Крік. Також підтримку отримали гранти Фонду Мейо на боротьбу з раком молочної залози, грант на рак передміхурової залози (CA91956) та Програма раку молочної залози Мейо.