предметів

реферат

Метою нашого дослідження було розробити неінвазивний пренатальний тест на аутосомно-рецесивні моногенні умови та продемонструвати його загальну доцільність та потенціал для клінічної інтеграції.

методи:

Ми усиновили вагітну жінку та її чоловіка, у якого була дитина пробанда, яка страждала на вроджену глухоту, і отримали дані про секвенування цільової області з напіввикористовуваного поля, що використовувало геномну та материнську ДНК плазми від трьох поколінь цієї родини. Була розроблена стратегія, яка підтримується гаплотипом, щоб визначити, чи успадкував плід патогенні мутації у збуднику гена GJB2. Батьківський гаплотип був побудований з використанням стратегії тріо з використанням двох різних процесів, а саме процесу поетапного використання дідусем і бабусею та допоміжного гаплотипу та процесу поетапного використання гаплотипу з допоміжним спробдом. Потім фетальний гаплотип отримували із даних послідовності плазми крові матері та батьківського гаплотипу.

результати:

Рівні точності гаплотипів по батьківській та материнській течіях, отримані шляхом поетапного гаплотипу, яким допомагали бабусі та дідусі, становили 99, 01 відповідно. 97, 36%, а процедура поетапного використання гаплотипу, що підтримується пробандом, дала дещо нижчу точність 98, 73 та 96, 79%. Успіх плоду патогенного гена було правильно отримано в обох процесах.

висновок:

Наше дослідження показує, що стратегія неінвазивного пренатального тестування на основі гаплотипу для моногенних станів має потенційне застосування в клінічній практиці.

Genet Med 16 12, 972 - 976.

Головний

Оскільки в материнському кровообігу була виявлена ​​ДНК плоду ссавців (cffDNA), були розроблені різні неінвазивні пренатальні аналізи, щоб уникнути ризику, який становлять традиційні процедури інвазивного відбору проб. 1, 2, 3, 4, 5, 6 Неінвазивні технології, що базуються на секвенуванні, націлені на цитогенетичний рівень, швидко розвиваються та є клінічно доступними. 4.5 Однак технології моногенних захворювань все ще перебувають на експериментальній лабораторній стадії. 7, 8, 9, 10

У нашому попередньому дослідженні 10 ми запропонували надійну математичну модель, яка могла б точно відновити як феномен генотипу, так і фетальний гаплотип за один крок, таким чином досягнувши повної характеристики геному плода. Однак це дослідження було обмежене суворими вимогами до зразків і не було підтверджене реальними клінічними зразками.

У цьому дослідженні брали зразки крові у вагітної жінки та найближчих родичів трьох поколінь її сім'ї, включаючи бабусь і дідусів, батьків та сестру-пробанда, для проведення неінвазивного пренатального тестування на вроджену глухоту. Ми створили батьківські гаплотипи, використовуючи стратегію тріо, та успішно провели пренатальне тестування на стан плода, використовуючи інформацію, отриману від бабусь і дідусів або пробандів. Наше дослідження забезпечує надійний практичний метод неінвазивного пренатального тестування на вроджену глухоту шляхом секвенування плазми крові матері.

Матеріали і методи

Вибірка та виявлення причинних мутацій

Ми усиновили вагітну жінку, її дружину та три покоління її сім’ї, серед яких була дочка-пробанд, чиї аудіограми показували тяжку та глибоку двосторонню втрату слуху. Генетичне консультування було надано родині, а пренатальне тестування - як варіант. Через ризик вродженої приглухуватості плода батьки обрали неінвазивний пренатальний тест. Усі учасники цього дослідження були прийняті та отримали інформовану згоду відповідно до Гельсінської декларації. Етичні схвалення надані відповідними інституційними радами всіх установ, що беруть участь. Периферичну кров та навколоплідні води отримували у вагітної жінки на 17 та 18/19 тижнях вагітності. Для батьківської конструкції гаплотипу були взяті зразки периферичної крові у чотирьох бабусь і дідусів. Ланцюгова реакція полімерази та секвенування Сангера використовувались для аналізу типу мутації в гені GJB2 ( Додаткова таблиця S1 та малюнки S1 та S2 в Інтернеті). Батько та дід по батькові були носіями c.299delAT. Вагітна мати та дідусь по матері були носіями c.235delC. Зонд являв собою гетерозиготну сполуку для мутацій.

Підготовка та послідовність бібліотеки

Геномна ДНК обох батьків, а також усіх чотирьох бабусь і дідусів з периферійної крові була фрагментована ехолотом. Плазму матки виділяли за допомогою двоступеневого протоколу центрифугування. Після завершення остаточного процесу ремонту та A-хвоста адаптери лігували до кожного кінця фрагментів ДНК. Код ДНК вводили в кожен зразок під час ланцюгової реакції полімерази для масивного паралельного секвенування. Захоплення цільової області проводили на спеціально розробленому 181, 37 M NimbleGen EZ-масиві (що містить весь екзом, 1 M однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) та основну область комплексу гістосумісності) відповідно до інструкцій виробника. Бібліотеки Postcapture послідовно використовували платформу Illumina Hiseq 2000 з парним кінцевим секвенуванням на 90 bp.

Вирівнювання та виклик SNP

Послідовні парні кінцеві показання наносили на порівняльний геном людини (Hg19, GRCh37) за допомогою SOAP2. 11 Видалення показань, які можна було відобразити на декількох сайтах і які були посилені в процесі полімеразної ланцюгової реакції. Потім ми здійснили виклик SNP за допомогою програмного забезпечення SOAPsnp у цільовій області. 12 Критерії фільтру (охоплення> 8 та значення якості> 20) були встановлені для забезпечення точності геномного генотипу.

Оцінка концентрації циркулюючої cffDNA

У локусах, які були гомозиготними у обох батьків, але мали різні генотипи, генотип плода був обов’язковим гетерозиготним за законами Менделя. Таким чином, фракційну концентрацію ДНК плода в материнській плазмі можна було розрахувати за локусами, для яких генотип матері був гомозиготним і для яких передбачуваний генотип плода був гетерозиготним. Це можна описати як відношення подвоєного числа специфічних алелів плодів, отриманих від батька, до загальної базової кількості інших алелів. 7, 10

Побудова батьківського гаплотипу

Ми створили батьківський гаплотип, використовуючи стратегію тріо, засновану на законі Менделя. Для процесу бабусь і дідусів, яким допомагали гаплотипи (GAHP), був побудований батьківський гаплотип з кожною тріо батьків та бабусь і дідусів. Для процесу фазування гаплотипів за допомогою пробандів (PAHP) були побудовані батьківські гаплотипи з тріо батька, матері та пробанда.

Висновок плодового гаплотипу

Ми використали зв'язок зв'язування, отриманий з батьківських гаплотипів, та базовий розподіл, розрахований шляхом секвенування плазми, для отримання вродженого фетлотипу. Імовірності можливих комбінацій гаплотипів розраховували для кожного локусу. Відповідно до характеристик рекомбінації процесу гаметогенезу, ми розрахували ймовірності переносу, використовуючи відстань між сусідніми ділянками, щоб створити приховану модель Маркова. У процесі декодування цієї моделі ми використовували алгоритм Вітербі, щоб знайти найбільш вірогідну послідовність прихованих станів та вивести спадкові явища гаплотипу та рекомбінації у плода. 13

результат

Примирення та побудова батьківського гаплотипу

Після захоплення цільової області

Продукти збагачення, що становлять від 20 до 30 разів, піддавали послідовному кінцевому секвенуванню 90 п.н. ( Додаткова таблиця S2 в Інтернеті). Всі показання були узгоджені з людським еталонним геномом і здійснено дзвінок SNP. Згідно з інформацією SNP, частка концентрації cffDNA у плазмі крові матері оцінювалася в 15,10%.

Батьківські гаплотипи були побудовані з використанням двох стратегій: процесу GAHP та PAHP. За допомогою GAHP область 104, 91 Мб батьківських гаплотипів була успішно фазована, з 149 628 маркерами кандидатів, розподіленими по всьому геному. За допомогою PAHP було успішно створено область 104,93 Мб, яка містить 168167 маркерів кандидатів.

Дедукція спадку плодового гаплотипу

У материнській плазмі ми створили прихований ланцюжок Маркова, використовуючи дані батьківського гаплотипу та послідовності плазми ( Фігура 1 ), в яких умови були приховані справжніми генотипами плода, а спостережуваними умовами були суміші глибини материнської послідовності та генотипів плазми плода. Після процесу декодування ми отримали спадковий гаплотип та події рекомбінації у плода. Використовуючи батьківський гаплотип, отриманий від GAHP, ми успішно вивели 126 600 локусів плода і виявили, що спадковий гаплотип плода мав 33-кратну рекомбінацію, а спадковий матері - 139 разів. Використовуючи стратегію PAHP, ми отримали 146 103 локусів із 60- і 181-кратною рекомбінацією в успадкованому гаплотипі по батькові та матері ( Додаткова фігура S4 і таблиця S3 онлайн).

неінвазивне

Блок-схема неінвазивної стратегії пренатального тестування . ( a ) Генетична карта цієї родини. b ) Блок-схема експериментального трубопроводу та біоінформатики. cffDNA, безклітинна ДНК плода; HMM, прихована модель Маркова.

Повнорозмірне зображення

Для оцінки загальної точності передбачуваного плодового гаплотипу ми створили стандартний гаплотип, використовуючи стратегію тріо з інформацією про батьків та клітини навколоплідних вод ( Додаткова таблиця S3 в Інтернеті). За допомогою GAHP 98, 15% гетерозиготних локусів батьківського гаплотипу були правильно отримані в 67978 локусах, а 95, 19% гетерозиготних локусів материнського гаплотипу були правильно отримані в 69346 локусах. Для PAHP результат був правильним для 97, 56% гетерозиготних локусів батьківського гаплотипу та 94,00% гетерозиготних локусів материнського гаплотипу, що приблизно на 1% менше, ніж результати, отримані за стратегією GAHP (онлайн Таблиці S1 та S4 в Інтернеті). ).

Оцінка помилок висновку гаплотипу

Батьківський гаплотип, отриманий в процесі PAHP, містив рекомбінацію в пробанді. Таким чином, похідний від PAHP фетальний гаплотип рекомбінований двічі. Він продемонстрував вищі випадки рекомбінації порівняно з фетальним гаплотипом, що походить від GAHP, що може призвести до більшої кількості помилок гаплотипу навколо подій рекомбінації. Для подальшого дослідження цього ефекту подій рекомбінації ми розрахували коефіцієнт помилок однонуклеотидних варіацій у кожній 1-Мб області в геномі ( Додаткова фігура S4 і таблиця S5 в Інтернеті). У процесі GAHP 23, 87% помилок у батьківському гаплотипі та 11, 74% помилок у материнському гаплотипі були розташовані на відстані 1 Мб навколо точок зупинки. Однак у процесі PAHP 30,12% помилок гаплотипу батьків та 23,66% помилок гаплотипу матері були зосереджені навколо точок рекомбінації переломів плода та 9,83% помилок гаплотипу батьків та 11,83% помилок гаплотипу. Кількість помилок у материнському гаплотипі було близьким до точки рекомбінації пробанда. Таким чином, ми дійшли висновку, що стратегія PAHP збагатила помилки рекомбінації пробанда, вказуючи на меншу точність порівняно зі стратегією GAHP.

На додаток до ефекту подій рекомбінації, помилки висновку також були пов'язані з фазовими помилками фазового гаплотипу батьків та аномальними концентраціями cffDNA. У процесі батьківського гаплотипового етапу помилки виведення можуть бути пов’язані з низькою якістю інформації про ОНП бабусь і дідусів, батьків та пробандів і могли б перекриватися процесом поетапного виведення. Тому ми використали гаплотипи батьків, пробандів та плоду для відтворення процесу рекомбінації та виявили кілька спорадичних точок рекомбінації, які демонстрували лише ізольований сигнал рекомбінації в регіонах, менших 100 kb. У стратегіях GAHP та PAHP приблизно 29% помилок брали участь у цих локусах, що свідчить про те, що точне визначення SNP у геномній ДНК є важливим для всього процесу аналізу. На відміну від геномної ДНК, cffDNA у материнській плазмі була фрагментована природним руйнуванням, що характеризується нестабільною частиною геному людини. Ми виявили екстремальні локуси концентрації cffDNA (за межами 99% довірчого інтервалу широкого профілю геному) і виявили, що приблизно 30% помилок наближалося.

Неінвазивне пренатальне тестування на вроджену глухоту

Ми провели пренатальне тестування на вроджену глухоту на основі вродженого гаплотипу в гені GJB2. Тут ми визначили батьківські гаплотипи як hap0 та hap1, щоб відрізнити патогенність. У GAHP батьківський патогенний алель, успадкований від діда по батькові, називається f0, а непатогенний алель - f1. Патогенний алель матері називається m0, а інший - m1. Для кодування прихованої моделі Маркова спадковість плодового гаплотипу щодо гена GJB2 становила f1 та m0, що вказує на те, що плід був гетерозиготним носієм мутації c.235 delC. У PAHP, оскільки пробанд був типовим пацієнтом із вродженою глухотою, ми визначили батьківські алелі, успадковані пробандом, як hap0, а інші - як hap1. Нарешті, фетальний гаплотип гена GJB2 також був f1 і m0, що відповідало результатам стратегії GAHP ( Малюнок 2 ). Звіт про діагноз Китайської лікарні загальної практики (Пекін, Китай) підтвердив наш висновок ( додаткова фігура S3 в Інтернеті). У цьому дослідженні генетичний тест базувався на аналізі плодового гаплотипу замість детального генотипу.

Результати неінвазивного тесту на вроджену глухоту . ( a ) Спадкові шляхи батьківських алелів, отримані за стратегією GAHP. ( b ) Спадкові шляхи батьківських алелей, отримані за стратегією PAHP. ( c ) Збільшений вигляд локусів навколо гена GJB2 з використанням стратегій як GAHP, так і PAHP; обидві стратегії показують, що плід успадкував алелі hap f1 та hap m0. На всіх графіках сині елементи представляють батьківські алелі, а червоні - материнські (світлі кольори вказують на спадщину від бабусь, а темні - на спадкування від бабусь і дідусів). Рядки нижче нуля (чорні лінії) вказують на те, що плід успадкував патогенний алель, а рядки вище нуля вказують на те, що плід успадкував доброякісний алель. GAHP, гаплотип фазування бабусь і дідусів; PAHP, фаза гаплотипу за допомогою пробанда.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Приблизно 1% дорослих носить мутантні алелі. Серед новонароджених мутантні алелі разом становлять приблизно 20% дитячої смертності та

10% дитячих госпіталізацій. Існує потреба у розробці ефективних методів діагностики, зокрема пренатальної діагностики, з метою покращення якості життя суспільства в цілому. Вроджена приглухуватість - це поширене клінічне генетичне захворювання з частотою 1-3% у новонароджених. Ранні пренатальні тести на зниження слуху можуть надати сім’ям більше можливостей для навчання, а також забезпечити час, щоб закласти основу для генетичної терапії найближчим часом. 17, 18, 19

У цьому дослідженні ми використовували трирівневу стратегію як з бабусями, дідусями, так і з пробандами, включаючи методи GAHP та PAHP. Обидва методи можуть визначити правильні батьківські гаплотипи, щоб забезпечити зв'язування зв'язків для виведення вродженого плодового гаплотипу, хоча точність PAHP була нижчою через накопичення рекомбінації у нащадків. Тому наш метод придатний для неінвазивного пренатального тестування сімей із хворобами Менделя, які можуть бути отримані з батьківських гаплотипів бабусь і дідусів чи пробандів. З іншого боку, секвенування цільової геномної ДНК не вимагає складних експериментальних процедур, таких як описані раніше методи, підтримувані гаплотипом, і є економічно вигідним, якщо розроблено відповідний масив. Час виконання, включаючи процес відбору зразків та тестування на платформі HiSeq2500, також може бути менше 1 тижня, а біоінформаційний аналіз може бути виконаний протягом 1 дня, забезпечуючи такий тип процедури для великих клінічних застосувань. 8, 9

Однак все ще існує кілька недоліків цього методу, які слід враховувати. По-перше, ми створили батьківський гаплотип на основі даних послідовностей тріо в одній родині, що суттєво обмежує доцільність нашого методу для неповних сімей, для яких ці дані відсутні (хоча в більшості клінічних випадків постраждала дитина хвора). причина пренатального тестування). По-друге, наше тестування базувалося на остаточній відповідності між хворобою та спорідненим геном, тому воно може застосовуватися лише для захворювань, для яких патогенний ген хвороби повністю досліджений. Тому наш метод в основному застосовується до генетичних розладів Менделя. Ефективні алгоритми ідентифікації мутацій de novo ще не розроблені. Існують також важливі етичні проблеми, пов’язані з неінвазивним визначенням пренатального геному, особливо, коли ми переходимо до більш вичерпних та зручних методів. Однак існує багато клінічних сценаріїв, коли такий підхід був би корисним, включаючи тестування на смертельні захворювання або стани, які можуть призвести до інших ускладнень зі здоров’ям.

Загалом, ми запропонували перспективну неінвазивну пренатальну стратегію тестування на вроджену глухоту шляхом масивного паралельного секвенування материнської плазми. Підхід, заснований на гаплотипі, описаний у цьому дослідженні, може бути поширений на неінвазивне пренатальне тестування більшості моногенних захворювань.

розкриття інформації

XL, HG, FC, YZ, WX, XP, SC, PL, CZ, JC, HJ, XX і WW - співробітники BGI-Шеньчжень. Інші автори не заявляють про будь-який конфлікт інтересів.