матерів

  • Предмети
  • Резюме
  • Передумови:
  • Мета:
  • Методи:
  • Результати:
  • Завершення:
  • Вступ
  • Матеріали і методи
  • Тварини та дієти
  • Пероральна толерантність до глюкози, збільшення ваги та тест на споживання їжі
  • Колекція тканин
  • Експресія гена гіпоталамуса
  • Аналіз концентрації фолатів
  • Глобальний аналіз метилювання ДНК гіпоталамуса
  • Статистичний аналіз
  • Результати
  • Споживання їжі, збільшення ваги та реакція на глюкозу
  • Експресія гена гіпоталамуса
  • Статус фолата
  • Глобальний статус метилювання
  • Обговорення

Предмети

  • Експресія гена
  • Гіпоталамус
  • Харчові добавки
  • Ожиріння

Резюме

Передумови:

Висока полівітамінна дієта (10 разів AIN-93G, HV), яку годували щурами Вістар під час вагітності, підвищували характеристики метаболічного синдрому у нащадків після відлучення від рекомендованої вітамінної дієти (РВ).

Мета:

Визначити, чи впливають гестаційні дієти на ВГ на обезогенні фенотипи у нащадків як наслідок зміненого гіпоталамусного контролю над поведінкою годування та чи можна запобігти їх підвищеному споживанню їжі, годуючи їх ВГ або високим вмістом фолатів (у 10 разів фолатів, HFol) дієти

Методи:

Чоловіче потомство матерів, котрих годували ВГ дієтою під час вагітності, відлучених від дієт RV, HV або HFol, порівнювали з тими, хто народився у матерів, які страждали на RV, і відлучили від дієти RV 29 тижнів. Споживання їжі протягом 72 год та масу тіла вимірювали кожні два тижні та щотижня відповідно. Відповідь глюкози на навантаження глюкозою вимірювали через 18 тижнів після відлучення. Експресія гіпоталамічного гена нейропептидів, пов’язаних з їжею, включаючи нейропептид Y, про-опіомеланокортин (POMC), рецептор інсуліну, рецептор лептину, нейротрофічний фактор, отриманий з мозку (BDNF), рецептори допаміну (DopaR1/2/5) та серотонін (SeroR1A/2A/2C), а також глобальне метилювання ДНК та концентрацію фолієвої кислоти в мозку та плазмі крові вимірювали через 29 тижнів після відлучення.

Результати:

Дієта щенят HV або HFol збільшила концентрацію фолієвої кислоти в мозку та плазмі і запобігла збільшенню споживання їжі (5%, Р = 0,03), маси тіла (8%, Р = 0,0006) та реакції глюкози на навантаження глюкозою (36%, Р = 0,02 ), виявлений у тих, хто харчується РВ-дієтою. Експресія аноректичних POMC (P = 0,004) та BDNF (P = 0,02) була вищою, а DopaR1 була нижчою (P = 0,06) у цуценят, які годувались дієтою HV. Дієта щенят HFol частково привела BDNF до рівня контролю (P = 0,02) та знизила рівень SeroR2A (P = 0,008). На експресію інших генів це не впливало. Загальне метилювання ДНК було подібним між групами дієт.

Завершення:

Обезогенний фенотип у нащадків видобутої HV їжі запобігається харчуванням дієт щенят HV або HFol, можливо через модуляцію регуляторних механізмів прийому їжі після відлучення.

Вступ

Матеріали і методи

Тварини та дієти

Принципова схема дослідження ( до ) дизайн та ( b ) протокол для нащадків чоловічої статі від 0 до 29 тижнів після відлучення. Абревіатури дієт: RV, дієта AIN-93G з рекомендованими вітамінами; ВГ, в 10 разів більше рекомендованої полівітамінної суміші; HFol, RV + 10-кратний вміст фолатів. Дієта, споживана під час вагітності, вказана перед тире. Дієти, споживані потомством, позначаються після тире.

Повнорозмірне зображення

Пероральна толерантність до глюкози, збільшення ваги та тест на споживання їжі

Малюнок 1b описує протокол дослідження. Споживання їжі протягом 72 год вимірювали кожні 2 тижні від 0 до 29 тижнів після відлучення. Вагу тіла вимірювали при народженні та під час відлучення, а збільшення ваги обчислювали щотижня від 0 до 29 тижнів після відлучення. Відповідь глюкози на глюкозний зонд (0,375 г глюкози на мл, 5 г глюкози на кг маси тіла) вимірювали через 18 тижнів після відлучення. Щурів голодували протягом ночі протягом 10 год перед вимірюванням глюкози. Зразки крові відбирали з хвостової вени, а базальну глюкозу негайно тестували за допомогою комерційного глюкометра (MediSense Precision Xtra, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA). Після вимірювання глюкози концентрацію глюкози в крові визначали через 15 і 60 хвилин і розраховували площу збільшення під кривою.

Колекція тканин

Мозок цілих щурів швидко видаляли після обезголовлення на 29 тижні після відлучення і негайно заморожували на сухому льоду, а потім зберігали при -80 ° C. Мозок розморожували на льоду, а праву та ліву сторони гіпоталамуса розтинали окремо, використовуючи метод описані вище. 14 Оптичний хіазм був використаний як демаркація передньої частини гіпоталамуса. Це проходить через передню комісуру, яка використовувалася як горизонтальна межа. Лінія між заднім гіпоталамусом і тілами ссавців вважалася каудальним розрізом. Розсічені блоки гіпоталамуса містили складні преоптичні, супраоптичні, паравентрикулярні, передні, супрахіазматичні, дорсомедіальні, вентромедіальні, дугоподібні, соскові, задні та бічні ядра. Права сторона гіпоталамуса використовувалася для відносної експресії гена, а ліва - для статусу метилювання ДНК. Ліву частину мозку, що залишився, використовували для вимірювання концентрації фолатів. Кров стовбура збирали і центрифугували, а також додавали зразки плазми з 0,5% аскорбінової кислоти для запобігання окисленню фолатів.

Експресія гена гіпоталамуса

Кожен розсічений гіпоталамус гомогенізували за допомогою гомогенізатора розриву тканини (Qiagen Tech., Mississauga, ON, Канада). РНК гомогенізованих зразків виділяли за допомогою реагенту Trizol та екстрагували хлороформом згідно з протоколом виробника (Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) та визначали кількісно за допомогою Nanodrop 1000. КДНК синтезували за допомогою набору архівів кДНК високої ємності на система ABI (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США) Система генного підсилення ПЛР 2700.

RT-PCR у реальному часі проводили на системі виявлення послідовностей ABI PRISM 7000, використовуючи аналізи Taqman для наступних генів, отриманих від ABI: нейропептид Y (Cat # Rn01410146_m1); про-опіомеланокортин (POMC; Cat # Rn00595020_m1); рецептор інсуліну (Cat # Rn00567070_m1); рецептор лептину (Cat # Rn01433205_m1); нейротрофічний фактор, отриманий з мозку (BDNF; Cat # Rn02531967_s1); рецептор дофаміну 1 (DopaR1; Cat # Rn03062203_s1); рецептор дофаміну 2 (DopaR2; Cat # Rn00561126_m1); рецептор дофаміну 5 (DopaR5; Cat # Rn00562768_s1); рецептор серотоніну 1A (SeroR1A; Cat # Rn00561409_s1); рецептор серотоніну 2A (SeroR2A; Cat # Rn01468302_m1); рецептор серотоніну 2C (SeroR2C; Cat # Rn00562748_m1). Умови циклу становили 50 ° C протягом 2 хв, 95 ° C протягом 10 хв, 40 циклів при 95 ° C протягом 15 с і 60 ° C протягом 1 хв. Відносний метод кількісного визначення проводили з використанням гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (Cat # Rn99999916_s1) як ендогенного контролю, який був обраний на основі попереднього обстеження щодо найменших коливань. Результати були виражені як кратна зміна методом 2 ΔΔCT 15 та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення ABI DataAssist версії 3.0.

Аналіз концентрації фолатів

Концентрацію фолатів у плазмі та мозку визначали мікробіологічним аналізом мікропланшетів з використанням Lactobacillus casei. 16, 17

Глобальний аналіз метилювання ДНК гіпоталамуса

ДНК виділяли за протоколом, описаним у наборі DNeasy Blood and Tissue (Qiagen Tech.). Два спектрофотометричні показники зразків ДНК були усереднені для визначення концентрації, яка мала співвідношення А 260 до А 280 між 1,8 і 2,0 і не мала забруднення РНК та білками.

Загальний статус метилювання геномної ДНК гіпоталамусу визначали методом аналізу прийняття метилу in vitro, як описано вище. 18, 19 У цьому аналізі беруть участь 3 H-метил-S-аденозилметионін (New England Nuclear, Бостон, Массачусетс, США) як опосередкований метилтрансферазою ДНК Sss1 донор метилу (New England Biolabs, Pickering, ON, Канада). Відомо, що прийнятність метильних груп у всьому геномі обернено пов'язана з екзогенним включенням 3H-метилу. Всі зразки проводили у двох примірниках, а повний аналіз проводили двічі. CV внутрішньо- та міжтестового аналізу становив 5%.

Статистичний аналіз

Вплив лікування на збільшення ваги та споживання їжі протягом 72 годин аналізували, використовуючи модельну процедуру PROC MIXED у SAS (Версія 9.2, SAS Institute Inc., Carey, NC, USA), включаючи гестаційні дієти, дієти для цуценят та час як основні фактори. Засоби в кожну часову точку та експресію гена гіпоталамуса, статус фолієвої кислоти та реакцію глюкози порівнювали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з використанням PROC GLM з подальшим тестом Тукі після прийому. Значні відмінності були зареєстровані при P

Прийом їжі протягом 72 год. Потомства чоловічої статі від 0 до 29 тижнів після відлучення. Абревіатури дієт: RV, дієта AIN-93G з рекомендованими вітамінами; ВГ, в 10 разів більше рекомендованої полівітамінної суміші; HFol, RV + 10-кратний вміст фолатів. Дієта, споживана під час вагітності, вказана перед тире. Дієти, споживані потомством, позначаються після тире. Дієта (P = 0,03), час (P ab Суттєво відрізняється відповідно до моделі повторних вимірювань PROC MIXED. Значення є середніми ± sem, n = 12–14 на групу.

Повнорозмірне зображення

Вага тіла нащадків чоловічої статі від 0 до 29 тижнів після відлучення. Абревіатури дієт: RV, дієта AIN-93G з рекомендованими вітамінами; ВГ, в 10 разів більше рекомендованої полівітамінної суміші; HFol, RV + 10-кратний вміст фолатів. Дієта, споживана під час вагітності, вказана перед тире. Дієти, споживані потомством, позначаються після тире. Збільшення ваги: ​​дієта (P = 0,0006), час (P ab Суттєво відрізняється відповідно до моделі повторних вимірювань PROC MIXED. Значення є середніми ± sem, n = 12-14 на групу.

Повнорозмірне зображення

Реакція глюкози в крові на навантаження на глюкозу (5 г глюкози на кг маси тіла) як додаткова площа під кривою (iAUC) чоловічих нащадків через 18 тижнів після відлучення. Абревіатури дієт: RV, дієта AIN-93G з рекомендованими вітамінами; ВГ, в 10 разів більше рекомендованої полівітамінної суміші; HFol, RV + 10-кратний вміст фолатів. Дієта, споживана під час вагітності, вказана перед тире. Дієти, споживані потомством, позначаються після тире. ab P = 0,02 одностороннім дисперсійним аналізом з подальшим пост-хок-тестом Тукі. Значення - це середнє значення ± sem, n = 8-12 на групу.

Повнорозмірне зображення

Експресія гена гіпоталамуса

Дієта HV, але не HFol щенят, забезпечувала експресію POMC для контролю рівнів у зрілих нащадків дам HV (P = 0,004) (Малюнок 5а). Дієта HV для цуценят привела експресію BDNF до рівня контролю, але дієта для щенят HFol лише послабила зниження експресії, спричинене гестаційною дієтою HV (P = 0,02) (рис. 5а). Тільки дієта для цуценят HFol знижувала експресію SeroR2A порівняно з потомством HV, відлученим від дієти для цуценят VR (P = 0,008) (рис. 5b). Спостерігалася тенденція до зниження рівня експресії DopaR1 у потомства ВГ, відлученого від раціону цуценят ВГ, порівняно з потомством РВ (Р = 0,06) (Рисунок 5b). Не було впливу гестаційних та цуценятних дієт на експресію гіпоталамусу інших генів.

Експресія гена гіпоталамуса ( до ) нейропептид Y (NPY), про-опіомеланокортин (POMC), рецептор інсуліну (InsR), рецептор лептину (LepR) та нейротрофічний фактор, отриманий з мозку (BNDF), та ( b ) рецептори дофаміну (DopaR1/R2/R5) та рецептори серотоніну (SeroR1A/2A/2C) у нащадків чоловічої статі через 29 тижнів після відлучення. Абревіатури дієт: RV, дієта AIN-93G з рекомендованими вітамінами; ВГ, в 10 разів більше рекомендованої полівітамінної суміші; HFol, RV + 10-кратний вміст фолатів. Дієта, споживана під час вагітності, вказана перед тире. Дієти, споживані потомством, позначаються після тире. ab Суттєво відрізняється одностороннім дисперсійним аналізом з подальшим пост-хок-тестом Тукі. Значення - це середнє значення ± sem, n = 4–7 на групу.

Повнорозмірне зображення

Статус фолата

Рівень фолатів у мозку (рис. 6а) та у плазмі крові (рис. 6б) не впливав на дієти для здобичі, але був підвищений за допомогою дієти для щенят HV або HFol.

Хоча було показано, що фолат є активним учасником реакцій переносу метилу, дієта гестації або після відлучення не впливала на загальне метилювання. Однак це не дивно, оскільки попередні дослідження повідомляли про метилювання ДНК генів за відсутності помітної зміни загального метилювання, що припускає, що епігенетичні зміни є специфічними для певної ділянки. 33 Крім того, дієти RV, HV та HFol у нашому дослідженні містять велику кількість холіну, що є ще одним фактором, що впливає на метилювання ДНК, 34, 35 і, можливо, лише затуманило виявлення впливу фолієвої кислоти на метилювання. Метаболізм холіну та інших вітамінів метильної групи (тобто фолатів, вітаміну В6 та В12) тісно пов'язані. 36

Значною слабкістю дослідження є відсутність вимірювання експресії генів на різних стадіях зрілості. Тому ми не знаємо стадії дозрівання, коли дієти після відлучення змінювали гіпоталамус. Окрім генів гіпоталамусу, вимірювання генів в областях мозку, що беруть участь у винагороді та мотивації, могло сприяти більш повному розумінню загального впливу дієт на регулювання споживання їжі. Показано, що миші, яких годували після відлучення від їжі з високим вмістом жиру (60% калорій з жиру), мали меншу експресію гена μ-опіоїдного рецептора, який впливає на схеми винагороди в вентральній тегментальній ділянці, ядрі. Accumbens та префронтальній кора. 37

На закінчення, обезогенний фенотип у нащадків видобутої HV жертви може бути наслідком зміненого гіпоталамічного контролю поведінки годування, але його можна запобігти, годуючи HV або HFol дієтами для щенят.