вентральній

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • звір
  • Інтра-ін’єкція VTA
  • Прийом їжі
  • Рухова активність
  • Оперативно реагує
  • електрофізіологія
  • Флуоресцентне сортування клітин
  • Кількісна ПЛР
  • ґрунтовки
  • Розгортання FA у нейронах DA
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • Внутрішньо-VTA-олеат пригнічує споживання їжі та стимулює рухову активність
  • Олеат In-VTA пригнічує їжу
  • Олеат модулює модуляцію нейрональної активності DA
  • Білки DA Neurons Express FA-Handling Proteins
  • ФА приймаються DA нейронами
  • обговорення
  • висновок
  • Фінансування та розкриття інформації
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • Жирні кислоти
  • Харчова поведінка
  • нейрофізіологія
  • Нагорода

реферат

Довголанцюгові жирні кислоти (ФА) - це метаболічні сигнали, які визначаються централізовано для регулювання енергетичного гомеостазу. Початкова робота показала, що нейрони гіпоталамусу змінюють швидкість стрільби у відповідь на FA (Oomura et al., 1975), тоді як нещодавні дослідження показали вплив централізованого введення FA на придушення печінкового харчування та вироблення глюкози (Lam et al., 2005; Obici et al., 2005;, 2002; Schwinkendorf et al., 2011). Як повідомляється, здатність ФА інгібувати прийом їжі та модулювати вегетативні функції та нейротрансмісію опосередковується клітинним транспортом ФА та внутрішньоклітинним метаболізмом (Lam et al., 2005; Le Foll et al., 2013; Moulle et al., 2013; Обічі та ін., 2003). Показано, що блокування гідролізу ФА від триацилгліцерину в головному мозку збільшує апетит і збільшення маси тіла (Cansell et al., 2014; Picard et al., 2014b).

Існує кілька доказів того, що вплив ФА на енергетичний метаболізм залежить від хімічної структури ланцюга ФА. Мононенасичений олеат FA (OA) та насичений FA пальмітат (PA) є найбільш поширеними довголанцюговими FA в циркуляції і можуть надавати різні сигнальні та метаболічні ефекти в мозку. Показано, що ОА, найбільш поширена в природі ФА, зменшує споживання їжі при гострому введенні в третій шлуночок (Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011) і інгібує або збуджує нейрони гіпоталамусу (Jo et al., 2009; Le Foll et al., 2009; Wang et al., 2006). Крім того, ми показали, що ОА має чітку внутрішньоклітинну метаболічну долю в нервових клітинах порівняно з ПА (Taib et al, 2013).

Матеріали і методи

Експерименти були схвалені Комітетом CRCHUM з питань захисту тварин, Комітетом з етики тварин при Університеті Монреаля та Комітетом з питань інституційного догляду та використання тварин в Медичній школі в Нью-Джерсі. Всі поведінкові тести проводили на щурах для підтримання точних мікроін’єкцій VTA, тоді як решту експериментів проводили на мишах завдяки наявності трансгенних ліній та методів, встановлених для первинних нейрокультур DA. Самців щурів Wistar (Charles River, Saint-Constant, Quebec) вагою 250-280 г після прибуття утримували за 8-10 днів до операції в кімнатах зворотного циклу (світло вимикається на 1000 годин). Самців мишей C57B1/6 (віком 4-6 тижнів) використовували для електрофізіологічних записів. Трансгенних мишей TH-eGFP (фон C57B1/6), що експресують зелений флуоресцентний білок (GFP) під контролем промотору тирозингідроксилази (TH) (Matsushita et al., 2002), використовували для сортування активованих флуоресценцією клітин (FACS). Первинні культури нейронів DA були отримані від постнатальних (P0 - P2) мишей C57B1/6 (Fasano et al, 2008).

Інтра-ін’єкція VTA

Стереотаксичну операцію проводили під анестезією ізофлураном і регулювали координатами атласу мозку атласу щурів (Paxinos and Watson, 1998). Щурам імплантували двосторонню направляючу канюлю (калібр 26, пластмаса одна), яка закінчувалась на 2 мм над VTA (5,8 мм позаду брегми, ± 0,6 мм від середньої лінії та -6 мм від твердої мозкової оболонки). OA і PA (Na +; Sigma-Aldrich) комплексували з гідроксипропіл-β-циклодекстрином (HPB, CTD Holdings, Alachua, FL, USA) і розчиняли в спинномозковій рідині (aCSF, в мМ: 125 NaCl, 2,5, 5 KCl, 0,3 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 глюкози, 1,3 MgSO 4 і 2,4 CaCl 2; pH 7,4) до кінцевої кількості 6 нмоль на сторону. Доза 6 нмоль становить 1/5 дози, використаної в попередніх дослідженнях оцінки годівлі у відповідь на ОА і ПА третьої камери в комплексі з HPB (30 нмоль - Obici et al., 2002; Schwinkendorf et al., 2011). Оскільки ми виявили значну аноректичну реакцію на 60 нмоль, але не на 30 нмоль, інфузії ОА у бічний шлуночок (дані не наведені), ми використовували камеру 10: 1 для розведення паренхіми для отримання дози 6 нмоль внутрішньо-VTA . Флоретин (EMD Millipore) розчиняли в 15% етанолі і розводили до 100 мкМ в aCSF. Речовини доставляли в обсязі 500 нл на сторону зі швидкістю 100 нл/хв за допомогою двосторонньої внутрішньої канюлі (Plastics One), яка виступала на 2 мм за направляючою канюлею.

Прийом їжі

Дві когорти щурів (загальна n = 41) були використані для оцінки впливу внутрішньо-VTA OA та PA на споживання їжі. Щури звикли до порошкоподібної дієти з їжею протягом 4-7 днів. Їжу видаляли за 3 години до ін'єкції OA або транспортного засобу, або PA або транспортного засобу, що сталося безпосередньо перед початком темного циклу. Ємності з їжею, наповнені порошкоподібною їжею, встановлювались у більший контейнер для лову розливу. Споживання їжі та вага тіла контролювали через 2, 6, 12 та 21 годину після ін’єкції.

Рухова активність

Амбулаторну активність оцінювали в метаболічних камерах (AccuScan Instruments, Columbus, OH, USA), у яких щурів звикли за 24 години до ін'єкції ФА. Ін'єкції робили безпосередньо перед настанням темної фази.

Оперативно реагує

Інша група щурів (n = 10) з двосторонніми канюлями VTA була навчена реагувати на 45 мг гранул з високим вмістом жиру та цукрози з високою сахарозою (TestDiet, Сент-Луїс, Міссурі, США) для прогресивного коефіцієнта ампліфікації в робочих камерах щурів з підйомними важелями (Med Associates, St. Albans, VT, USA), як описано раніше (Sharma et al., 2012). Як тільки була досягнута стабільна відповідь на припинення лікування, оцінювали ефекти ін’єкції у внутрішньо-VTA-носій, а потім ін’єкцію ОА наступного дня. Після стабілізації стабілізації порушень (кількість отриманих врожаїв не змінилося більш ніж на 15%) оцінювали реакцію оператора у тих самих тварин у відповідь на носій, а потім спільну ін'єкцію ОА + флоретину (100 мкМ в 0,5% етанолі ). Тестування поведінки починалося через 1 годину після ін’єкції на початку темної фази. Розташування канюлі перевіряли ін’єкціями метиленового синього (500 нл на сторону) після завершення експерименту.

електрофізіологія

Флуоресцентне сортування клітин

Мишей P0-P2 кріоанестезували та обезголовлювали для збору тканин. Як було описано раніше (Fulton et al., 2011; Mendez et al., 2008), свіжо дисоційовані клітини були підготовлені з VTA і GFP-позитивних нейронів, очищені FACS і безпосередньо зібрані в тризолі (Qiagen, Toronto, ON, Canada).

Кількісна ПЛР

Загальну РНК з мікродисекцій VTA та вентромедіального гіпоталамуса (VMH) та клітин, відсортованих за FACS, екстрагували Trizol. Концентрацію та чистоту РНК оцінювали систематично. РНК реверсували транскрипцію в кДНК, використовуючи зворотну транскриптазу вірусу мишачого лейкозу Молоні (M-MLV RT, Life Technologies, Burlington, ON, USA). Гени ампліфікували за допомогою набору для ПЛР Rotor-Gene SYBR Green PCR (Qiagen) у присутності відповідних пар праймерів. Результати нормалізували до β-актину або циклофіліну та аналізували із застосуванням стандартного методу кривої (Taib et al, 2013).

ґрунтовки

Праймери були розроблені з використанням BLAST (Національна медична бібліотека США) та синтезовані Integrated DNA Technologies на основі наступних послідовностей: actb (β-актин) вперед: 5-′TTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3 ', зворотний: 5'-ACCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3; cd36 вперед: 5'-TGCATGAATTAGTTGAACCAGGCCA-3 ', реверс: CCACAGTTCCGATCGCAGCC-3', ппія (циклофілін) вперед: 5'-GCTTTTCGCCGCTTGCTGCA-3 ', реверс: TGCAAACCAGCA fabp3 вперед: 5'-GATGACCGGAAGGTCAAGTC-3 ', зворотний: 5'-GCCATGAGTGAGAGTCTCGAGA-3'; fabp5 вперед: 5'-AAACCGAGAGCACAGTGAAGA-3 ', реверс: 5'-AAGGTGCAGACCGTCTCAGT-3'; fabp7 вперед: 5'-AGTACATGAAGGCTCTGGGCGTG-3 ', реверс: 5'-ATCACCACTTTGCCGCCTTCCT-3'; fatp1 вперед: 5'-GCAGGTACTACCGCATTGCT-3 ', назад: 5'-GAACTTCTTGCGCAGTACCA-3'; fatp4 вперед: 5'-TGTGGTGCACAGCAGGTATT-3 ', назад: 5'-TTTCCTGCTGAGTGGTAGAGG-3'; gad1 (GAD67) вперед: 5'-ATATCATTGGTTTAGCTGGTGAATG-3 ', назад: 5'-GTGACTGTGTTCTGAGGTGAAGAG-3'; вперед: 5'-CGACCCGTGGCCGGTCTAC-3 ', реверс: 5'-GCAGTCTGGCTCGGGTGAGTG-3'.

Розгортання FA у нейронах DA

Нейрони DA середнього мозку, вирощені на коріальному гліальному шарі, отримували з мишей дикого типу P0-P2, як описано (Fasano et al, 2008). Поглинання FA оцінювали за допомогою C1-BODIPY 500/510-C12, флуоресцентного аналога FA, який нагадує хімічну структуру довголанцюгового FA з головкою флуорофору (20 мкМ в 0,8% DMSO; ThermoFisher). Через десять днів після інокуляції клітини обробляли BODIPY, BODIPY + флоретином (100 мкМ в 0,5% -ному етанолі) або окремим носієм у культуральному середовищі (Neurobasal, доповнений глутамаксом) протягом 45 хвилин. Після трьох промивань крижаним PBS клітини фіксували 10% формаліном протягом 10 хвилин. Імунофлюоресценцію TH проводили, як описано раніше (Fulton et al., 2011). Аналітичний інструмент ImageJ (//imagej.nih.gov/ij/) був використаний для визначення інтенсивності флуоресценції BODIPY. Для кожної умови інтегральну щільність вимірювали у збільшених × 63 полях (n = 45), отриманих з трьох окремих покривних склін на кожну умову.

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM і були проаналізовані за допомогою GraphPad Prism (версія 5.02 для програмного забезпечення Windows GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Двонаправлений дисперсійний аналіз (ANOVA) з пост-тестами Бонферонні використовували для аналізу даних про споживання їжі та рухову активність. Односторонній ANOVA використовували в електрофізіології та імунофлюоресценції з пост-аналізами Bonferonni. Дані, що реагують на оператора, та кількісна ПЛР (qPCR) були проаналізовані за допомогою t-критерію Стьюдента. Статистичну значимість встановили на рівні p = 0,05.

результат

Внутрішньо-VTA-олеат пригнічує споживання їжі та стимулює рухову активність

Ми перевірили гострий вплив внутрішньо-VTA OA та PA на споживання їжі. Як показано на малюнках 1a та b, OA суттєво пригнічував споживання їжі через 12 годин після ін’єкції (носій: 23,9 ± 1,3 г, OA: 19,6 ± 1,6 г; зниження на 18%; повторні виміри двонаправленої ANOVA; F 1, 21 = 4, 47, p 0,05) або рухомого руху (F 1, 16 = 0,07, p> 0,05; Рисунок 1c і d). Двосторонні координати канюлі VTA підтверджені ін’єкціями мікросфер родаміну (додатковий малюнок S1A). Аноректичні ефекти OA або PA не були пов’язані з місцевим запаленням, оскільки рівні мРНК IL-1 та TNFα у VTA не змінювались після ін’єкції OA (OA: IL-1 p: t17 = 0,29; TNFα: t17 = 0,35 PA: IL - lp: t4 = 0,84, TNFα: t4 = 1,25, p> 0,05, додаткові зображення S1B та C).

Внутрішньо-VTA-олеат пригнічує споживання їжі та стимулює рухову активність. a, b) Двостороння мікроін’єкція OA (6 нмоль/бік) зменшила споживання їжі (a) і підвищила рухову активність (b). (c, d) Ін’єкція ПА у VTA в еквівалентній концентрації не впливала на споживання їжі (c) та рух (d). n = 8–13/група оцінки споживання їжі; n = 7–10/група для експерименту з фізичної активності. Результати виражаються як середнє значення ± SEM. Подвійне повторне вимірювання ANOVA, * p 0, 05) або реактивні гранули з високим вмістом жиру/цукру (додаткова фігура S3); t5 = 1,05, р> 0,05). Однак це запобігло реакції ослабленої точки розриву, індукованої ОА (t6 = 0,31, p> 0,05; Рисунок 2b). Ніяких змін у співвідношенні правильної та неправильної депресій важеля не спостерігалось (ОА: t7 = 0,27; ОА + флоретин: t6 = 0,66, р> 0,05; Рисунок 2в та г). Подальша гістологічна оцінка показала, що двосторонні канюлі поміщали у VTA у всіх щурів (рис. 2д).

Олеат притупляє корисний вплив їжі з високим вмістом жиру та цукру. а) Ін'єкція OA внутрішньо-VTA зменшила точку зупинки, яка відповідала на пелети з високим вмістом жиру/сахарози в хірургічному завданні з поступовим співвідношенням. б) Спільна ін’єкція блокатора транспортера блокатора телоретину запобігла ефекту ОА. (c, d) Жодне лікування не впливало на відсоток правильних реакцій важеля. д) розміщення ін’єкційної канюлі; кожен символ позначає різного щура (n = 7). Результати виражаються як середнє значення ± SEM. * р 0, 05).

Олеат модулює модуляцію нейрональної активності дофаміну. а) Записи спонтанної електричної активності нейронів VTA DA з клітинних термінальних терміналів. ОА зменшила частоту потенціалу дії (APF) більшості зареєстрованих нейронів DA. Спільне введення флоретину запобігало індукованому ОА пригнічення APF. n = 6. б) Репрезентативний запис. Потенціал мембранної кімнати позначається горизонтальною пунктирною лінією та відображається зліва. (c, d) Записи напруги затискачів, що показують, що ОА зменшували амплітуду (I mEPSC, c) і частоту (d) мініатюрних збудливих постсинаптичних струмів в інгібованих ОА нейронах, ефект, який запобігає флоретину. n = 7. д) Репрезентативні сліди. Відхилення вниз представляють mEPSC. Результати виражаються як середнє значення ± SEM. Односторонні стандартні (а) або багаторазові міри (в, г) ANOVA. * p # p ### стор

Профіль експресії генів білків, що маніпулюють жирними кислотами, у нейронах дофаміну та VTA. Нейрони DA (GFP +) та клітини, які не є DA (GFP-), були відсортовані за допомогою FACS від мишей TH-eGFP. Нейрони GFP + були дофамінергічними, що підтверджується високим рівнем мРНК TH та відсутністю мРНК GAD67. Циклофілін служив еталонним геном, і всі результати (крім TH та GAD67) нормалізувались до значень, отриманих з тканини VMH. FABP, білок, що зв’язує жирні кислоти; FATP, транспортний білок жирних кислот; GAD67, глутаматдекарбоксилаза; TH, тирозингідроксилаза.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

ФА приймаються DA нейронами

Внутрішньоклітинний транспорт FA оцінювали за допомогою BODIPY, довголанцюгового флуоресцентного аналога FA. Застосування BODIPY до первинних нейронів DA призвело до точкового мічення в імунопозитивних нейронах TH (TH +), а також у маркуванні в клітинах, що не є TH (Рисунок 5e, збільшений через 5 годин). Оптична Z-візуалізація та ортогональна реконструкція виявили клітинне маркування сферичної форми, що нагадує краплі ліпідів у клітинах TH + та процесах (рис. 5е та f). Розмір включення BODIPY зменшували додаванням флоретину в інкубаційне середовище (рис. 5f та g). Застосування BODIPY значно збільшило інтенсивність флуоресценції клітин (виражену як інтегральне значення щільності) порівняно зі станом носія, тоді як одночасне введення флоретину послаблювало інтенсивність мічення флуоресценції в нейронах TH + (F 2, 44 = 502, 0, p = 0, 0001; 5j).,

Споживання жирної кислоти в первинних нейронах дофаміну. Застосування довголанцюгового аналога FA BODIPY до культурального середовища призвело до внутрішньоклітинної пунктуації (зелений) у цитоплазмі, а також до процесів DA нейронів, ідентифікованих за допомогою імунофлюоресценції TH (червоний). (a, d, g) Використання транспортного засобу. b, e, h) нанесення BODIPY (20 мкМ). (c, f, i) Застосування BODIPY (20 мкМ) + флоретину (100 мкМ). j) Значення інтенсивності флуоресценції BODIPY в умовах обробки. Три слайди для однієї умови. Результати виражаються як середнє значення ± SEM. Одностороння ANOVA. *** p ### p