пецифічна

  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткові матеріали та методи
  • Додаткові таблиці легенд
  • Додаткові легенди зображення
  • Файли Excel
  • Додаткова таблиця 1
  • Додаткова таблиця 2
  • Файли зображень
  • Додаткова фігура 1
  • Додатковий малюнок 2
  • Додатковий малюнок 3

TRAF3, білок-адаптер цитоплазми, нещодавно був визначений кандидатом-супресором пухлини в ряді В-клітинних новоутворень людини. Гомозиготні делеції та інактивуючі мутації гена Traf3 були виявлені в неходжкінській лімфомі, включаючи лімфому крайової зони селезінки (MZL), хронічний В-клітинний лімфолейкоз, лімфому мантійних клітин, а також множинну мієлому та макроглобулінемію Вальденстрема. 1, 2, 3, 4 Однак, незалежно від того, чи делеції або мутації TRAF3 відіграють причинно-наслідкову роль у лімфомагенезі В, очікується подальше дослідження in vivo з використанням мишей-нокаутів TRAF3.

Нещодавно ми створили умовний алель із втратою функції гена Traf3, що дозволяє специфічно делетувати TRAF3 у В-клітинах у мишей (миші B-TRAF3 -/-). Ці миші демонструють дуже поширені популяції В-клітин у вторинних лімфоїдних органах через надзвичайно тривале виживання незалежних від BAFF зрілих В-клітин, що згодом було підтверджено Гардамом та співавт. 6 TRAF3 і TRAF2 зібрані для формування регуляторного комплексу з cIAP1/2 та NIK для інгібування сигнального шляху NF-κB. 7, 8 Ці спостереження визначають центральну роль осі TRAF3-NIK-NF-KB2 у регуляції виживання В-клітин. Тривале виживання В-клітин є відомим фактором, що схильний до розвитку аутоімунітету та В-лімфоми. 9, 10 старіння B-TRAF3 -/- мишей розвинули високий рівень аутоантитіл до дволанцюжкової ДНК у сироватці крові, а також імунокомплексний гломерулонефрит. Сам аутоімунітет вважається фактором ризику В-лімфоми у пацієнтів із системною червоною вовчаком або синдромом Шегрена. Отже, миші B-TRAF3 -/- можуть бути схильні до злоякісних пухлин В-клітин. Тут ми повідомляємо, що миші B-TRAF3 -/- спонтанно розвивали клонові лімфоми селезінки MZL або B1a у віці до 18 місяців.

Ми вперше відзначили, що миші B-TRAF3 -/- значно зменшували виживання у віці> 9 місяців (рис. 1а). Ми дослідили тканини 50 мишей B-TRAF3 -/- у віці 9-18 місяців, 18, які піддавались розтину після смерті, та 32, які не мали зовнішніх ознак захворювання на момент дослідження. Всі 18 загиблих мишей B-TRAF3 -/- та 20 з інших 32 (62,5%) мали лімфому В селезінки (Додаткова таблиця 1). Грубі спостереження та мікроскопічні дослідження також виявили ураження лімфоми інших тканин, включаючи кістковий мозок, шийні та брижові лімфатичні вузли, нирки, легені та печінку, а також асцит (малюнки 1b та ​​c та додатковий малюнок S1 та додаткові матеріали та методи). На основі критеріїв класифікації Bethesd лімфоїдних новоутворень 12 пухлини мишей B-TRAF3 -/- селезінки були MZL, включаючи як високоякісний MZL з цитологією центробластичних дифузних великих B-лімфоцитів, так і низькоякісний MZL з ознаками нормальних Клітини MZ B.

Повнорозмірне зображення

Крім того, ми використовували проточну цитометрію для характеристики імунофенотипових особливостей пухлинних клітин, що знаходяться в селезінці, кістковому мозку та асциті (рис. 1d та додатковий малюнок S2). Дані проточної цитометрії від 21 окремих мишей зведені в Додаток Таблиця 2. Відповідно до гістологічних діагнозів, імунофенотипічні профілі пухлини були характерними для зрілих В-клітинних лімфом. За одним винятком, всі аналізи канонічних зрілих В-клітинних маркерів - B220, CD19, IgM, IgD та IgK або Igλ - були позитивними в різному ступені. Одним винятковим випадком (27-9) був IgG + IgM - IgD - з 20% CD138 +. Імунофенотипічні профілі дев'яти досліджених лімфом нагадували профіль клітин В1а, тоді як інші два випадки нагадували профіль клітин В1b. В решті 10 випадків було 5 CD5 - CD11b - CD21 + CD23 - які нагадували нормальні клітини MZ B. Більше половини (11/21) лімфом TRAF3 -/- B походило з B1 B-клітин, а ще 23% (5/21) - MZ B-клітин. Це свідчить про те, що в багатьох випадках, діагностованих гістологічно як центробластичні дифузні великі В-клітинні лімфоми, насправді були високоякісними MZL селезінки.

Далі ми провели Саузерн-блот-аналіз гена IgH первинних зразків пухлини від 21 особини мишей B-TRAF3 -/- для визначення їх клональності. Результати (рис. 1е) виявили наявність однієї або декількох смуг, що не містять зародкових ліній, у кожній з досліджуваних ДНК, вказуючи на моноклональні або олігоклональні розширення злоякісних В-клітин. ДНК, приготована з двох або трьох тканин однієї і тієї ж миші, часто демонструвала переставлені смуги однакового розміру, що вказує на метастатичне поширення того самого клону.

Ці спостереження змусили нас шукати більш прямих доказів злоякісної трансформації шляхом внутрішньоочеревинного переносу пухлинних клітин із відомими клональними популяціями мишам із імунодефіцитом NOD SCID. Через 2-3 місяці після передачі мишей-реципієнтів було виявлено інфільтрати лімфоми в декількох тканинах. Трансплантовані пухлини мали ті ж імунофенотипові особливості, що і популяція донорів (рис. 1f). Саузерн-блот-аналіз показав, що одна або дві клонові популяції від первинних лімфом TRAF3 -/- B проліферували у мишей-реципієнтів NOD SCID (рис. 1g). Таким чином, спонтанні В-лімфоми, що розвинулись у мишей B-TRAF3 -/-, є клональними, злоякісними та піддаються трансплантації.

Щоб отримати додаткову інформацію про походження, розподіл та історію злоякісних В-клітин, ми клонували та секвенували IgH V (D) J-область лімфом від 11 мишей B-TRAF3 -/(Таблиця 1). Послідовності IgH У ділянці 10 з 11 обстежених мишей вони не виявляли значної соматичної гіпермутації, припускаючи, що вони походять не від статевих клітин, пасажованих в центрі, а від наївних прегермінальних середніх клітин B, клітин MZ B або клітин B1 . Цікаво, що всі основні послідовності VH, виявлені в лімфомах TRAF3 -/- B, належали до однієї з чотирьох сімейств VH, VH1 (J558), VH3 (VH36-60), VH5 (VH7183) і VH12. Ці сімейства генів часто використовують MZ, B1 або аутореактивні В-клітини. Отже, послідовності IgH V (D) J разом із гістопатологічними та імунофенотиповими даними дозволяють класифікувати В-лімфоми, розвинені у більшості мишей B-TRAF3 -/-, як лімфоми селезінки MZL або B1.

Стіл в натуральну величину

Раніше ми продемонстрували конститутивну активацію NF-κB2 та зменшення ядерної транслокації PKC5, але нормальну активацію NF-κB1, індуковану CD40, у TRAF3 -/- B, що передозлоякісні клітини.5. Тут ми розширили наш аналіз цих шляхів до B-TRAF3 -/- мишачі лімфоми. Ми виявили, що підвищений ядерний рівень субодиниць NF-kB2, p52 та RelB та знижений рівень ядерних рівнів PKC5 також свідчать про первинні лімфоми В (рис. 2а). Цікаво, що лімфоми TRAF3 -/- B також дещо підвищували рівень ядер NF-κB1. Таким чином, сигнальний ландшафт лімфом TRAF3 -/- B характеризується конститутивною активацією шляхів NF-kB2 та NF-KB1 (хоча і в меншій мірі), а також зменшенням ядерної транслокації PKC5.

Повнорозмірне зображення

Щоб перевірити, чи можуть аберрантні шляхи активації NF-κB служити терапевтичними мішенями для новоутворень В-клітин, пов’язаних з інактивацією TRAF3, ми оцінили ефекти препаратів, що модулюють активацію NF-κB, використовуючи первинні клітини B-лімфоми, очищені B-TRAF3, на життєздатність клітин . -/- миші. Ми використовували інгібітор IKK2, BMS-345541, 13 та інгібітор NF-κB, орідонін. 14 Вплив цих речовин порівнювали з ефектами лікарських засобів, що застосовуються клінічно для лікування В-лімфом або лейкемій - вінкристин, вся трансретиноева кислота, доксорубіцин та циклофосфамід. Ми виявили, що орідонін демонстрував сильну дозозалежну тумороцидну активність на клітинах первинної лімфоми, тоді як BMS-345541 та чотири клінічні препарати були неактивними (малюнки 2b та c та додатковий малюнок S3).

Щоб зрозуміти механізми орідоніну, ми визначили рівні субодиниць NF-κB та NF-κB1 у цитозольних та ядерних екстрактах первинних В-лімфом. Рівні активованих NF-κB2 та NF-κB1 в ядрі значно знижувались у клітинах В-лімфоми, оброблених орідоніном (рис. 2г). Крім того, орідонін не впливав на ядерну транслокацію PKC5 або активацію ERK, p38, JNK та AKT (рис. 2г та дані не показані). Таким чином, потужний тумороцидний ефект орідоніну можна віднести до його активності у пригніченні активації NF-κB2 та NF-κB1, що припускає, що оридонін або тісно пов’язана речовина слід розглядати як нових кандидатів для лікування характерних новоутворень В-клітин. . генетична/епігенетична інактивація TRAF3.

Далі ми спробували спеціально знизити рівень NF-κB2, використовуючи лентивірусні вектори shRNA, щоб оцінити роль конститутивної активації NF-κB у лімфомагенезі TRAF3 -/- B. Ми протестували 4 вектори лентівірусної shRNA NF-κB2 shRNA. NF-κB shRNA 653 та 1226 пригнічували білки p100 та p52 NF-κB2 на -95% та 75% відповідно. Згодом ми використали ці лентівіруси shRNA для трансдукції клітинної лінії B-лімфоми TRAF3 27-9.5.3, що формується в цьому дослідженні (додаткові матеріали та методи). Цікаво, що NF-κB2 shRNA 653 та 1226 інгібували проліферацію та індукували апоптоз у клітинах 27-9.5.3. Важливо, що ефективність двох shRNA у згортанні білків NF-κB2 корелювала з їх здатністю інгібувати проліферацію та індукувати апоптоз у клітинах TRAF3 -/- B-лімфоми (рис. 3). Хоча необхідне підтвердження іншими лініями TRAF3 -/- B-лімфоми, наші дані свідчать про те, що конститутивна активація NF-κB2 є одним з основних онкогенних шляхів у клітинах TRAF3 -/- B.

NF-κB shRNAs індукували апоптоз у клітинах TRAF3 -/- B-лімфоми. Клітини В-лімфоми миші (клітинна лінія M12.4.1 в ( a ) і TRAF3 -/- клітинна лінія лімфоми В 27-9, 5, 3 в ( b, c, d )) були трансдуковані лентивірусами, що експресують мишачу NF-κB shRNA або скремблированную shRNA (SCR). a ) Сумарні рівні клітинних білків NF-κB2 р100 та р52, визначені імуноблот-аналізом. Білки готували з клітин В-лімфоми, трансдукованих шифрованою shRNA або NF-KBB shRNA 653, 1226, 2716 або 2996. Імуноблот актину використовували як контроль навантаження. ( b ) Криві росту живих клітин і (( c ) відсоток живих та мертвих клітин, що визначається підрахунком клітин, зафарбованих синім кольором. Графіки показують результати трьох незалежних експериментів (середнє значення ± sd). d ) Репрезентативні профілі FACS трансдукованих клітин, проаналізовані за допомогою фарбування анексином V та йодидом пропідію (PI). Апоптотичні клітини ідентифікували як анексин V + PI-, мертві клітини - анексин V + PI +, а живі клітини - анексин V-PI−. Дані представляють три незалежні експерименти.

Повнорозмірне зображення

Дослідження, що виявили делеції TRAF3 та мутації В-клітинного хронічного лімфолейкозу, MZL, лімфоми мантійних клітин, макроглобулінемії Вальденстрема та множинної мієломи, свідчать про потенційну супресивну функцію TRAF3. 1, 2, 3, 4 Парадоксально, але трансгенні миші, які надмірно експресують TRAF3 у В-клітинах, виявляють аутоімунне захворювання, системне запалення та схильність до раку. 15 Один із варіантів, представлений Запатою та ін. 15 полягає в тому, що TRAF3 може сприяти диференціюванню плазматичних клітин. В якості альтернативи, несподіваний фенотип трансгенних мишей TRAF3 може потенційно мати відношення до місця вставки трансгену в геномі, яке може впливати на експресію або функцію інших важливих генів, з огляду на те, що детально вивчена лише одна трансгенна лінія-засновник. 15 Тут спонтанний, дуже проникаючий розвиток В-лімфом у мишей B-TRAF3 -/- забезпечує переконливі докази того, що Traf3 є геном-супресором пухлини у В-клітинах.

Об'єднані дані, представлені в цьому дослідженні, дозволяють припустити, що миші B-TRAF3 -/- тісно моделюють MZL селезінки людини та хронічний лімфолейкоз В-клітин. Використовуючи клітини B-лімфоми, отримані від мишей B-TRAF3 -/- як модельних систем, ми показали, що орідонін та NR-KBB2 shRNAs мають терапевтичний потенціал. Отримані нами дані свідчать про те, що відновлення білка TRAF3 або його подальших сигнальних шляхів є важливим терапевтичним шляхом для В-лімфом. У зв'язку з цим миші B-TRAF3 -/- надають корисний інструмент для розробки та випробування терапевтичних препаратів для лікування В-клітинних новоутворень людини, які включають інактивацію TRAF3 або пов'язані генетичні/епігенетичні зміни.