грудне

  • предметів
  • реферат
  • мета:
  • Вивчати дизайн:
  • результат:
  • висновок:
  • вступ
  • методи
  • Дослідження населення
  • Підготовка зразка
  • Збір клінічних даних
  • серологія
  • Кількісний аналіз ПЛР у режимі реального часу
  • Підсилення UL144 гени та секвенування ДНК
  • Статистичний аналіз
  • результат
  • обговорення

предметів

  • педіатрія
  • Вірусна інфекція
  • Вірусна передача

реферат

Ми проспективно оцінили швидкість передачі постнатального цитомегаловірусу (ЦМВ) через грудне молоко у надзвичайно недоношених дітей, щоб вирішити вплив впливу ЦМВ-інфекції на недоношених дітей під час лактації.

Вивчати дизайн:

У дослідження було включено 25 матерів та 27 дітей (два набори близнюків) з вагою при народженні 1. Вроджена ЦМВ-інфекція пов’язана із значними довгостроковими наслідками, такими як сенсоневральна втрата слуху та розумова відсталість. 2, 3 На відміну від вроджених інфекцій, менше акцентується на наслідках отримання постнатальної ЦМВ, можливо, тому, що вона часто протікає безсимптомно і, як вважають, призводить до низької захворюваності. 4 Однак нещодавні дослідження, які показали, що постнатальні інфекції ЦМВ у недоношених дітей викликають серйозні клінічні ознаки, включаючи респіраторні компроміси, нейтропенію, тромбоцитопенію, гепатомегалію та септичні синдроми, знову викликали інтерес до впливу цього збудника у безпосередній постнатальний період. 5, 6, 7

методи

Дослідження населення

Це проспективне дослідження включало недоношених дітей на грудному вигодовуванні та їх матерів, госпіталізованих до Університетської лікарні Нагої, Першої лікарні Червоного Хреста Нагої та Муніципальної лікарні Огакі з 1 квітня 2003 р. По 30 вересня 2004 р. Дослідження включало недоношених дітей з гестаційним віком 2500 г. Комітет з питань етики кожного закладу схвалив дослідження, і всі батьки або опікуни отримали письмову інформовану згоду до зарахування.

Підготовка зразка

Проби крові відбирали у кожної матері для тесту на антитіла до ЦМВ протягом першого тижня після пологів; молозиво було видалено; і проби грудного молока відбирали кожні 2 тижні, поки не звільняли немовлят. Проби крові та сечі відбирали у кожного немовляти протягом 1 тижня після народження для скринінгу на вроджені інфекції ЦМВ; Потім проби крові та сечі брали кожні 2 тижні до виписки; під час виписки було відібрано ще один зразок крові для тесту на антитіла до ЦМВ. Коли донорське молоко дарували дітям, кожні 2 тижні відбирали проби донорського молока для скринінгу. У випадках, коли немовлятам переливали кров, частину препарату крові збирали для тестування. Всі перелиті препарати крові були заповнені лейко фільтрами. Перед використанням молозиво, грудне молоко, донорське молоко, препарати крові для переливання, зразки сироватки та сечі зберігали при -20 ° C.

Збір клінічних даних

Клінічні дані, такі як непереносимість їжі, розтягнення живота, гепатомегалія, петехії, апное та гіпотонія, були оцінені та записані відповідним лікуючим лікарем. Щотижня у немовлят брали зразки крові для скринінгу лабораторних відхилень, таких як нейтропенія, тромбоцитопенія, підвищений рівень печінкових ферментів та гіпербілірубінемія. Лікуючі лікарі були засліплені результатами ПЛР-аналізів у грудному молоці та серологічним статусом ЦМВ у матері.

серологія

Імуноглобулінові антитіла проти CMV (Ig) G та IgM були ідентифіковані за допомогою набору імуноферментних аналізів (Denka Seiken, Токіо, Японія).

Кількісний аналіз ПЛР у режимі реального часу

ДНК виділяли з 200 мкл дитячої сироватки, препарату крові та нефракціонованого грудного молока за допомогою набору крові QIAamp (Qiagen, Hilden, Німеччина) та елюювали у 100 мкл дистильованої води. ДНК виділяли із 140 мкл зразків сечі для немовлят за допомогою набору вірусної РНК QIAamp (Qiagen) і елюювали в 100 мкл дистильованої води.

ПЛР у реальному часі проводили для кожного витягнутого зразка ДНК, щоб кількісно визначити кількість копій ДНК CMV. ПЛР-праймери та зонди, використані в цьому аналізі, були розроблені для націлювання на безпосередній ранній ген CMV. 13 ПЛР у режимі реального часу проводили за допомогою комплекту TaqMan PCR Kit та детектора послідовності Model 7700 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США), як описано вище. 9, 14, 15 Межа виявлення цього аналізу становила 100 копій мл-1 .

Ампліфікація гена UL144 та секвенування ДНК

Коли ДНК CMV була виявлена ​​у зразках сечі або сироватки крові, проводили секвенування генів UL144. Ген UL144 ампліфікували за допомогою вкладеної ПЛР. Були використані наступні праймери для ПЛР: зовнішній прямий праймер (5'-TCGTATTACAAACCGCGGAGAGGGAT-3 '), зовнішній зворотний праймер (5'-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3'), внутрішній прямий праймер (5'-CTTCCGGTAGGCATGAA-3 ') і внутрішній зворотний праймер - GACTTAATCGTACCGTGA-3 '). Продукти ПЛР безпосередньо секвенувались за допомогою комплекту послідовності циклів термінатора BigDye та автоматизованого секвенсора ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems).

Статистичний аналіз

Відмінності в категоріальних змінних аналізували за допомогою тесту χ 2; Відмінності середніх значень аналізували за допомогою U-критерію Манна-Уітні. Статистичні аналізи проводили за призначенням при лікуванні Statview 5.0 (Інститут SAS, Берклі, Каліфорнія, США).

результат

Протягом періоду дослідження 25 матерів та 27 їхніх дітей (два набори близнюків) відповідали критеріям вступу. Середній термін вагітності становив 26,4 тижня (діапазон від 23, 7 до 32, 6 тижнів), а середня вага при народженні становила 802 г (діапазон від 512 до 1108 г). Медіана часу спостереження становила 99 днів (діапазон від 70 до 154 днів). Всього було 14 дітей, хлопчиків та 13 дівчаток. Сім дітей були доставлені вагінально, а 20 - кесаревим розтином.

Малюнок 1 показує серорозповсюдженість матерів CMV у нашій когорті та частоту передачі CMV. Всього 21 з 25 матерів (84%) були серопозитивними на ЦМВ. ДНК CMV була виявлена ​​в грудному молоці у всіх серопозитивних матерів. ДНК CMV не була виявлена ​​в грудному молоці серонегативних матерів протягом періоду дослідження. На малюнку 2 показано кількість копій ДНК CMV у грудному молоці, проаналізованому за допомогою ПЛР у реальному часі. Загалом 7 із 20 зразків молозива (35%) містили ДНК CMV. Через 2 тижні після пологів кількість копій ДНК CMV зросла і досягла максимуму через 4-6 тижнів після пологів. Вивільнення ДНК CMV у грудному молоці тривало до 8 тижнів після пологів. Через 10 тижнів після пологів ДНК CMV була виявлена ​​лише в одній пробі; Через 12 тижнів після пологів у грудному молоці не виявлено ДНК CMV.

Серопревалентність матері та передача цитомегаловірусу (ЦМВ). Показані серопродуктивність матері, швидкість лактації ДНК CMV та швидкість передачі CMV. Передача ЦМВ відбулася лише у одного пацієнта.

Повнорозмірне зображення

Кінетика числа копії ДНК цитомегаловірусу (CMV) у грудному молоці. Вказано середнє число копій ДНК CMV у всіх зразках молозива, а також грудне молоко 21 серопозитивних матерів CMV. Кількість копії ДНК CMV вимірювали за допомогою ПЛР в режимі реального часу. Номери копій ДНК молозива даються у віці 0 тижнів. Середні номери копій ДНК CMV позначені чорними крапками; Похибки відображають 95% довірчі інтервали. Пунктирна лінія показує межу виявлення тесту.

Повнорозмірне зображення

У всіх 15 з 27 дітей їх принаймні один раз годували донорським молоком. Донорське молоко постачалося одному пацієнту одним донором. ПЛР проводили загалом на 23 зразках молока донорів, а ДНК CMV виявляли у 13 з 23 (57%) зразків. В результаті 10 з 15 немовлят (67%) отримували ДНК-позитивне донорське молоко CMV. Одну дитину, мати якої була серонегативною, годували донорським молоком, але в донорському молоці, яке отримала дитина, не виявлено ДНК CMV.

Загалом 20 з 27 дітей потребували переливання еритроцитів. Середня кількість переливань еритроцитів становила 2 (від 1 до 8 разів). Кожному з 27 дітей було потрібно переливання тромбоцитів. ДНК CMV не була виявлена ​​в жодному зразку крові, що використовується для переливання крові.

У досліджуваній популяції анти-CMV IgM був негативним при виписці у всіх, крім однієї дитини. З 21 немовляти, матері яких мали позитивний результат на анти-CMV IgG, 4 дитини були позитивними на IgG CMV після виписки, але 17 були негативними. У 4 позитивних немовлят проби крові брали для тесту на антитіла до ЦМВ в середньому за 77 днів (діапазон від 70 до 84 днів) після пологів, що значно раніше, ніж у 17 негативних немовлят із середнім зразком крові за 98 днів. (діапазон від 70 до 154 днів) (Р = 0,02). Ці дані свідчать про те, що четверо позитивних дітей зберігали пасивно переданий анти-CMV IgG від своїх матерів. Всі п’ятеро дітей, матері яких мали негативний рівень антитіл до CMV IgG, мали негативний антитіл до CMV IgG при виписці.

обговорення

Діосі та ін. 17 вперше було виділено CMV із грудного молока в 1967 р. Подальші дослідження показали, що рівень вірулактії у фракціонованому молоці коливається від 9 до 32%. 18, 19, 20 Нещодавно реактивація материнських ЦМВ під час лактації була проаналізована методом ПЛР. 9, 10, 11, 12, 21, 22, 23 У цих дослідженнях рівень лактації ДНК CMV коливався від 87,5 до 97,3%. У нашому дослідженні всі серопозитивні матері мали ДНК CMV у грудному молоці. Ці висновки підтверджують думку, що реактивація ЦМВ відбувається під час лактації у більшості серопозитивних матерів. Ми кількісно визначили кількість копій ДНК CMV у грудному молоці за допомогою ПЛР у режимі реального часу та описали поздовжню кінетику реактивації CMV. У нашому попередньому дослідженні, в якому популяція була значно старшою, ніж у цьому дослідженні (середній термін вагітності, 31 проти 26 тижнів; P 9 2 тижні після пологів, ДНК CMV була виявлена ​​при підвищеному рівні грудного молока і досягла максимуму від 4 до 6 тижнів після пологів у цьому дослідженні кінетика реактивації ЦМВ була майже однаковою, що свідчить про те, що реактивація ЦМВ у матері не залежить від гестаційного віку при пологах і що реактивація ЦМВ під час лактації починається через 1-2 тижні після пологів і закінчується через 10 тижнів після пологів.

Ми виявили ДНК CMV у однієї дитини, яка отримувала CMV-позитивне молоко. Щоб підтвердити шлях передачі, ми провели молекулярно-епідеміологічне дослідження. Найпоширенішим геном варіанта штаму в людській ЦМВ є глікопротеїн В. 24 Однак минулого року значна увага була приділена гену CMV UL144. UL144 кодує гомолог медіатора проникнення вірусу герпесу, члена надсімейства рецептора фактора некрозу пухлини 1, і може бути генетичним маркером патогенезу ЦМВ людини. 25 Люрен та ін. 26 повідомили, що UL144 мав значну варіабельність послідовності, специфічну для штаму, і тому ми зосередили його на ідентифікації штаму. Всі послідовності, визначені в грудному молоці матері, точно відповідали послідовностям у зразках сечі їхньої дитини. Постнатальний ЦМВ можна отримати шляхом секреції шийки матки в родові шляхи, переливання крові та грудного молока. Наша одна заражена дитина народилася шляхом кесаревого розтину, але їй двічі зробили переливання крові. Усі препарати крові були лейкозаповнені, і, отже, ЦМВ в основному був ліквідований; насправді, ДНК CMV не була виявлена ​​ні в одному із зразків крові. Виконуючи молекулярну характеристику пари мати-дитина, ми підтвердили, що передача CMV відбувалася через грудне молоко.

Пастеризація може інактивувати ЦМВ у грудному молоці. 20, 32 Hamprecht et al. 34 повідомляється про зменшення зараженості CMV грудного молока трьома методами: заморожування та розморожування, пастеризація тримача та короткочасне нагрівання протягом 5 с при 72 ° C. Інфекційність CMV була усунена лише в 1 з 10 зразків заморожуванням молока, але повністю усувається пастеризацією Холдера та короткочасним нагріванням. Однак процеси нагрівання мають кілька проблем: нагрівання може негативно позначитися на якості грудного молока, процеси вимагають спеціального обладнання, грудне молоко займає багато часу, щоб його приготувати шляхом пастеризації власником та можливості небезпечних речовин, що витікають із пластикових пляшок. не можна виключати опалення. Курат та співавт. 7 не рекомендують загальний підхід, уникаючи або пастеризуючи грудне молоко, яке базується на низькому рівні симптоматичних захворювань, навіть у недоношених новонароджених з високим ризиком. Натомість, щоб запобігти серйозній інфекції, вони запропонували алгоритм для немовлят недоношених дітей у разі позитивної матері CMV IgG на основі стану здоров’я недоношених дітей. 36

На закінчення, згідно з кінетикою появи ДНК CMV у грудному молоці, реактивація ЦМВ починається через 1-2 тижні після пологів і закінчується через 10 тижнів після пологів. Навіть у надзвичайно недоношених дітей швидкість передачі ЦМВ була низькою, і жодне з дітей, які передавали ЦМВ, не розвинуло важких симптомів у наших закладах, де використовували переважно заморожене молоко. Заморожене та розморожене грудне молоко може зменшити частоту вертикальної CMV-інфекції та серйозних захворювань, хоча в рідкісних випадках цей метод не може повністю запобігти важким симптомам, подібним до сепсису, та некротизуючому ентероколіту. 5