Рекомендувати документи

поглиблений

Сучасні обстежувальні процедури та терапевтичні можливості при макулярній дистрофії Старгардта Докторська дисертація

Доктор докторатів клінічної медицини університету доктора Яноса Гаргітая Семмельвейса

Супервайзер: д-р Ágnes Farkas Офіційні судді: д-р László Kőhidai д-р Ágnes Kerényi Голова екзаменаційної комісії: Члени екзаменаційної комісії:

Д-р Бела Сенде д-р Габор Радо д-р Акос Лукац

Зміст 1. Список скорочень

4.1. Дослідження морфологічних змін сітківки Stargardt

при макулярній дистрофії методом оптичної когерентності з томографією 4.2. Зміна макулярного пігменту досліджував Старгардт при макулярній дистрофії за допомогою скануючої лазерної офтальмоскопії. 4.3. Дослідження гена ABCA4 при угорській макулярній дистрофії Старгардта

та його порівняння з фенотипом пацієнта 4.4. Можливості доставки гена GFP в пігментний епітелій сітківки та

тканини сітківки in vitro та in vivo 4.4.1. Створення вірусного вектора

4.4.2. Культура клітин епітеліального пігменту сітківки

4.4.3. Трансдукція in vitro

4.4.4. Трансдукція in vivo

4.4.4.1. Трансдукція in vivo без імуносупресії

4.4.4.2. Трансдукція in vivo шляхом імуносупресії

4.4.5. ІФА тест

4.4.6. Дослідження сітківки in vivo

4.4.7. Гістологічні дослідження

5.1. Дослідження морфологічних змін сітківки Stargardt

при макулярній дистрофії за допомогою оптичної когерентності з томографією 5.2. Старгардт досліджував зміну макулярного пігменту

при макулярній дистрофії за допомогою сканування за допомогою лазерного офтальмоскопа 5.3. Дослідження гена ABCA4 при угорській макулярній дистрофії Старгардта

група пацієнтів та її порівняння з фенотипом пацієнта 5.4. Можливості доставки гена GFP до пігментного епітелію сітківки та тканин сітківки in vitro та in vivo

5.4.1. Трансдукція in vitro

5.4.1. Трансдукція in vivo

5.5. Він підходить для подолання імунної відповіді, спричиненої білком GFP

вивчення методів 6. Обговорення

6.1. Дослідження морфологічних змін сітківки Stargardt

при макулярній дистрофії методом оптичної когерентності з томографією 6.2. Старгардт досліджував зміну макулярного пігменту

при макулярній дистрофії за допомогою скануючого лазерного офтальмоскопа 6.3. Дослідження гена ABCA4 при угорській макулярній дистрофії Старгардта

група пацієнтів та її порівняння з фенотипом пацієнта 6.4. Можливості доставки гена GFP в пігментний епітелій сітківки та

тканини сітківки, in vitro та in vivo 6.5. Він підходить для подолання імунної відповіді, спричиненої білком GFP

вивчення методів 7. Нові результати та їх клінічне значення

12. Список публікацій

12.1. Публікації, пов’язані з темою дисертації

12.2. Інші комунікації

12.3. Тези можуть бути цитовані за темою дисертації

12.4. Лекції за темою дисертації

13. Копії публікацій, що стосуються теми дисертації

1. Список абревіатур ABCR: АТФ-азозв’язуючий репортер AMD: дегенерація жовтої плями літнього віку ATP: аденозинтрифосфат A2E: N-ретинілідин-N-ретиніл-етаноламін Промотор CMV: промотор цитомегаловірусу CRD: дистрофія шпильки DMEM: модифікований Е Дульбекко E: посилений зелений флуоресцентний білок ІФА: імуноферментний аналіз EPON: гістологічний матеріал для вкладання ERG: електроретинографія FACS: флуоресцентний сортувальник клітин FT: фовеолярна товщина GFP: білий зелений флуоресцентний білок HRP: пероксидаза хрону ВПГ сіплексний вірус МВ: макулярний об’єм ОСТ: оптична когенерація OCT-з'єднання: низькотемпературний гістологічний матеріал для вкладання (для заморожених зрізів) PBS: забуференний фосфатом сольовий розчин RAL-PE: фосфатидил-ентаноламін сітківки RmP: білок оболонки RP: пігментний ретиніт SLO: скануючий лазерний офтальмоскоп STGD: макулярна дистрофія Stargardt (Макулярна дистрофія Старгардта) TBS: буферний розчин тришидроксиметиламінометану УФ: ультрафіолет

2. Вступ Найпоширеніша спадкова макулярна дистрофія, що викликає симптоми у молодому віці, була описана Карлом Старгардтом у 1907 р. (Stargardt 1909, 1918). Характерним симптомом захворювання є зниження центрального зору, яке зазвичай відбувається до двадцяти років. Віддалена гострота зору в кінцевому стані захворювання зазвичай стабілізується між 2-3-метровими показниками пальців та 0,1 (Markham et al. 1998). Читальна здатність сильно порушена, але не супроводжується порушенням кольорового зору. Реакції пацієнтів на ЕРГ Ганцфельда характеризуються переважанням порушень фотопічної функції, але подовження темпової адаптації також є поширеною скаргою. На ранній стадії зображення очного дна не завжди є патогномічним, і клінічний діагноз часто може бути поставлений лише у міру прогресування захворювання на основі характерних жовтувато-білих плям «слизової слизу» та/або атрофічних уражень жовтої плями «побитої бронзи». (Фігура 1)

Малюнок 1. “Слиз слимака” та “побита бронза” макулярні дистрофії (Hargitai et al. 2005) Частота захворювання оцінюється у 1: 10000; він успадковується переважно аутосомно-рецесивно, рідше аутосомно-домінантно. (Малюнок 2) Частота зустрічальності 1: 10000 1: 10000-1: 15000 немає даних 1: 5000-1: 25000

Макулярна дистрофія Штаргарда

Таблиця 1. Найпоширеніші успадковані макулярні дистрофії

У 1997 році Аллікметс та його колеги виявили ген, який був дефектним при аутосомному захворюванні.

(Kaplan et al. 1993; Allikmets 1997 et al.). Ген ABCR знаходиться в хромосомі 1 і відповідає за кодування трансмембранного білка, білка "ободок" (RmP), члена сімейства касетних транспортерів, що зв'язують аденозинтрифосфат (ATP) (Azarian et al. 1997). Білок RmP був вперше описаний у зовнішньому складі клітин жаб'ячих штифтів (Papermaster et al. 1978). Цей білок є фоторецептором

бере участь у транспортних процесах (Weng et al. 1999).

Рисунок 2. Функція білка RmP (rho: родопсин; ops: opsin; PE: фосфатидиленатоламін; atRAL: цілком транс-сітківка; arROL: повністю-транс-ретинол; N-RPE: N-ретинідил-фосфатидиленатоламін; DM: мембрана тромбоцитів: плазматична мембрана) Weng et al. 1999. Під впливом світла родопсин вивільняє цілком транс-сітківку в тромбоцитах зовнішніх кінцівок. Транс-сітківка зв’язується з фосфатидилетаноламіном (PE) у мембрані тромбоцитів. Отриманим продуктом є N-ретинілідин-PE (N-retPE). У разі здорового функціонування RmP N-ret-PE очищається від тромбоцитів, а потім повністю транс-сітківка перетворюється на повністю-транс-ретинол (atROL), який знову перетворюється на 11-цис-ретиналь за допомогою пігментного епітелію клітин. (Рисунок 2) Якщо білок RmP відсутній або не функціонує належним чином, N-ret-PE накопичується в просторі між тромбоцитами. Одним із наслідків накопичення буде те, що опсин активується великою кількістю надлишкової загальної транс-сітківки в тромбоцитах, що призводить до утворення повністю-транс-транс-сітківки (ops/atRAL). Це 6

супероксиддисмутаза) та водорозчинні антиоксиданти (глутатіон, вітамін С) (Conn et al. 1993, De La Paz et al. 1992). Сітківка особливо чутлива до окисного стресу, оскільки має дуже високу концентрацію кисню і піддається постійному високоенергетичному синьому світлу. Молекули, які поглинають ультрафіолетове та синє світло, значною мірою відіграють ключову роль у формуванні активних форм кисню, напр. ліпофусцин. Ці кисневі радикали викликають перекисне окислення ліпідів через пошкодження довголанцюгових ненасичених жирних кислот, які 10

може привести (Winkler et al. 1999). Каротиноїди відіграють помітну роль у виведенні вільних радикалів (Stahl et al. 1997; Leibler et al. 1997; Sundelin et al. 2001). Завдяки своїй розчинності в ліпідах вони зв’язуються з клітинними мембранами і є основними засобами захисту мембран з високим вмістом ненасичених жирних кислот у зовнішньому складі фоторецепторів (Winkler et al. 1999; De La Paz et al. 1992; Leibler et al. 1997 ). З віком прогресуюча загибель пігментних епітеліальних клітин, зменшення макулярного пігменту та накопичення ліпофусцину призводять до окислювального пошкодження сітківки та, як наслідок, зниження гостроти зору (Boulton et al. 1991; Curcio et al. 1993). В експериментальних умовах культури пігментних клітин, оброблені лютеїном та зеаксантином, можуть зменшити утворення ліпофусцину та індукований синім світлом апоптоз (Boulton et al. 1993). Постійне вживання дієтичних добавок, що містять лютеїн та зеаксантин, призводить до збільшення вмісту ксантофілу в крові, а згодом і в сітківці. Деякі дослідження показали, що більш високі концентрації ксантофілу в сироватці крові призводять до зниження швидкості дегенерації жовтої плями у похилому віці (Seddon et al. 1995; Snellen et al. 2002; Gale et al. 2003). THE

дослідження тривають. В даний час хвороба Старгардта, поряд з іншими макулярними дистрофіями, є невиліковною хворобою. Ці захворювання тяжко навантажують пацієнта, його сім'ю та суспільство в цілому. Рання діагностика може допомогти тим, хто бере участь, легше інтегруватися у суспільство та жити повноцінним життям з правильним вибором кар’єри. На сьогодні єдиною рекомендованою терапією СТГД є використання полівітамінних препаратів, що містять вітаміни, мікроелементи, антиоксиданти та фотопігменти, що інгібують раннє старіння сітківки та фоторецепторів у відповідних композиціях. На сьогодні найбільш часто використовуваними нами способами оптичної реабілітації є такі допоміжні засоби: біноклі, збільшувальний телевізор та кольорові окуляри (Fonda et al. 1985; Zrenner et al. 2002). Паралельно з розширенням діагностичних можливостей захворювань сітківки починалося все більше експериментів з метою лікування хвороб (Rattner et al. 1999). У цих експериментах проводилася трансплантація тканин, трансплантація стовбурових клітин та сітківки 11.

всі вірусні компоненти, необхідні для трансдукції, були усунені з вдосконаленого «безкишкового» аденовірусного вектора, але вірусний білок капсидів продовжує викликати імунну відповідь (Sakhukja et al. 2003; Kochanek et al. 2001; McKelvey et al. 2004). Ще одним недоліком аденовірусного вектора є те, що трансген є епізомально інтегрованим, так що не досягається безперервна експресія гена для лікування хронічних захворювань, але геном клітини-мішені не змінюється в результаті терапії. Аденосателітний вірус (AAV) дає можливість лікувати широкий спектр клітин-мішеней (Kaplitt et al. 1994; Lu et al. 2004). Розмір “імплантованого” трансгену невеликий (4-5 кб), і вектор не викликає імунної відповіді. Якщо потрібна доставка великого трансгену, результати можна отримати лише шляхом фрагментації гена, одночасної трансдукції двох векторів AAV (Nakai et al. 2000; Duan et al. 2000; Sun et al. 2000).

віддалені або закриті групи нейрональних клітин можна лікувати (Dull et al. 1998; Kim et al. 1998; Poeschala et al. 1998; Rohll et al. 2002). Останні лентивірусні вектори здатні «вмикати та вимикати» експресію трансгенів за допомогою регуляторної системи Tet (тетрациклін) (Pluta et al. 2005). Ця властивість може бути особливо важливою при лікуванні гострого захворювання. В даний час проводяться експерименти генної терапії з використанням лентивірусного вектора з такими нейродегенеративними захворюваннями, серед яких: хвороба Альцгеймера (Marr et al. 2003), хвороба Паркінсона (Kirik et al. 2004), хвороба Хантінгтона (Kells et al. 2004), та бічний аміотрофічний склероз (Kaspar et al., 2003). Око може бути ідеальним органом-мішенню для генної терапії кількома способами: воно легко доступне хірургічним шляхом, і терапія може легко контролюватися in vivo. За декілька спадкових захворювань сітківки в останні роки на моделях тварин було досягнуто часткової анатомії та функціональної реабілітації (вроджений амавроз Лебера, пігметоза сітківки, макулярна дистрофія Старгардта) (Takahashi et al. 1999; Acland et al. 2001; Bemelmans et al. 2006 Конг та ін. 2007).

Експериментальна тваринна модель хвороби Старгардта - це «нокаутована» миша abcr -/- у якої ген білка RmP видалений. У цих мишей було описано накопичення ліпофусцину та подовження темнової адаптації (Weng et al. 1999). Дослідження на abcr -/- мишах показали, що накопичення A2E зменшується, коли тварини утримуються в темряві (Weng et al. 1999). Виходячи з цього, ми можемо порадити пацієнтові якомога більше уникати сильного світла. Були зроблені спроби розробити препарати, що пригнічують накопичення А2Е в клітинах пігментного епітелію. Такий ефект ізотретиноїну був продемонстрований у abcr -/- мишей (Radu et al. 2003).

оцінка прогресування з використанням нових офтальмологічних діагностичних інструментів, а також картографування генетичного фону захворювання та дослідження in vitro та in vivo щодо надходження білка-індикатора за допомогою генної терапії. У своєму дослідженні ми шукали відповіді на такі питання: 1.

Чи ОКТ є придатним методом для вивчення морфологічних змін сітківки при макулярній дистрофії Старгардта?

2. Чи можна використовувати SLO для відстеження змін макулярного пігменту при макулярній дистрофії Старгардта? 3. Які мутації гена ABCA4 найчастіше трапляються в угорській групі маргаритно-дистрофічних пацієнтів Старгардта і як вони впливають на фенотип пацієнтів? 4. Чи здатний лентивірусний вектор вводити ген зеленого флуоресцентного білка GFP в пігментний епітелій сітківки та інші шари in vitro та in vivo? 5. Який метод підходить для подолання імунної відповіді, спричиненої білком GFP?

Для статистичної обробки з використанням лінійної регресії було використано програмне забезпечення Statistica 6.0 (Statsoft Inc., Тусла, США) та рівень значимості ap A ND L541P/A1038V G1961E 106delT G1961E ND ND L541P/A1038V G863A IVS40 + 5GE N 59DdG G ND ND ND IVS40 + 5G> A 5917delG L541P/A1038V D1532N ND ND L541P L541P/A1038V L541P/A1038V G863A L541P/A1038V ND G1961E ND ND ND P68L L541P/A1038V ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 5G> A

II. Таблиця F: самка; М: чоловічий; I, II, III: оцінка уражень очного дна за класифікацією Фішмана; FT: товщина фовеоли; МВ: об’єм плями; ND: Генетичних відхилень не виявлено. (Харгіта 2005)

Найкраще виправлена ​​гострота зору суттєво корелювала як із фовеолярною товщиною (рис. 8), так і з об’ємом жовтої плями (рис. 9).