цитотоксична

  • предметів
  • реферат
  • Передумови:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • Головний
  • результат
  • Розмір популяції клітин NK
  • Експресія мРНК інтелектину-2 в NK-клітинах, виділених з PBMC
  • Цитотоксичність NK-клітин
  • Експресія NK-асоційованих генів у NK-клітинах, виділених з PBMC
  • обговорення
  • методи
  • хімікати
  • BLF
  • Харчове лікування та протокол для тварин
  • Відбір проб
  • Ізоляція PBMC
  • Повна ізоляція клітин із селезінки та MLN
  • Виділення NK-клітин та фенотипова ідентифікація для чистоти
  • Тест на цитотоксичність NK-клітин методом проточної цитометрії
  • Фенотипова ідентифікація одноядерних клітин з крові та клітин з MLN та селезінки
  • Експресія гена NK-клітини
  • Статистичний аналіз
  • Звіт про фінансову підтримку
  • розкриття інформації
  • Додаткова інформація
  • Файли Powerpoint
  • Додатковий малюнок S1.

предметів

реферат

Передумови:

Клітини природних кілерів (NK) є частиною вродженої системи імунного захисту, і їх рівень різниться у немовлят та немовлят (FF). Лактоферин (Lf) модулює цитотоксичність NK-клітин ex vivo. Ми припустили, що харчовий Lf (bLf) великої рогатої худоби збільшить популяцію NK-клітин та цитотоксичність.

методи:

Поросят вирощували свиноматками (SR), FF або 1 г/л bLf (LF) протягом 21 доби. NK-клітини крові (CD3 - CD4 - CD8 +) (одноядерні клітини периферичної крові (PBMC)), селезінку та мезентеріальні лімфатичні вузли (MLN) визначали за допомогою проточної цитометрії. NKMC PBMCs тестували на цитотоксичну активність щодо клітин-мішеней K562 ex vivo у присутності середовища (нестимульованого), інтерлейкіну-2 або bLf. Експресію мРНК NK-клітин визначали методом зворотної транскрипції-кількісної ПЛР.

результати:

Поросята SR та LF мали більше NK-клітин у MLN (P = 0,0097) та селезінці (P = 0,0980), ніж поросята FF. У PBMC у поросят SR було більше NK-клітин, ніж у поросят FF (P = 0,0072); Поросята LF були середнього розміру і не відрізнялись від поросят FF або SR. Експресія мРНК інтелектину-2 в NK-клітинах була в 2,5 рази вищою (P = 0,0095) у LF, ніж у поросят SR або FF. Клітини NK у поросят у Словацькій Республіці показали вищі показники (P

Рівень інтелектину-2 мРНК був вищим у природних клітинах-кілерах 21-денних поросят, що годувались bLf (LF, n = 3), ніж у свиноматок, вирощених на свиноматках (SR, n = 7) або у сумішах, що годувались (FF, n = 6 ).) тварини. Нормалізовані значення інтелекту-2 розраховували шляхом ділення середнього значення цільової кількості на середню кількість еталонного гена (пептидилпролілізомерази А). Для кожного вимірювання множину різниці обчислювали діленням нормованих цільових значень на середнє нормоване цільове значення для свиней FF. Дані виражаються як середнє значення ± SD, що перевищує різницю порівняно з тваринами FF. * P

Цитотоксичність клітин природних кілерів (NK), виділених від 21-річних свиноматок (SR; n = 11; чорний), годують сумішшю (FF; n = 14; білий) і bLf-годують (LF; n = 11; сірий) поросята. Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) NK-клітини або нестимулювали (Unst), або стимулювали інтерлейкіном-2 (IL-2) (20 нг/мл) або Lf (25 мкг/мл) і інкубували протягом 48 годин з міткою DiOC18, міченою K562 клітини у співвідношенні ефектів до клітин-мішеней 10: 1. Наприкінці інкубації для позначення мертвих клітин додавали йодид пропідію (PI). Цитотоксичність повідомляється як вбиті клітини-мішені (PI + DiOC 18 +) у відсотках від загальної кількості клітин-мішеней (DiOC 18 +). Дані виражаються як середнє значення ± SD. Повна модель узагальненої лінійної моделі (GLM), P †, представляє суттєві відмінності між дієтами. bLf, бичачий лактоферин.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Експресія NK-асоційованих генів у NK-клітинах, виділених з PBMC

З метою виявлення можливих молекулярних механізмів, які можуть сприяти зниженню цитотоксичної активності NK-клітин тварин FF та LF, була проведена зворотна транскрипційно-кількісна ПЛР на РНК, витягнутій з нестимульованих клітин CD3 - CD4 - CD8 + NK ( малюнок 3). ). Надлишок мРНК перфорину, ефекторної молекули для NK-клітин, був у три рази і в шість разів нижчим у NK-клітинах поросят FF та LF відповідно, ніж у іРНК поросят SR (P = 0,0038, Малюнок 3а ). Крім того, експресія рецептора D 2 для NK 2, що входить до групи 2 (NKG2D), активуючого рецептора, виявленого на NK-клітинах і відомого як підгрупа K-рецепторів 1 для клітин-лектинів Killer типу 1 (KLRK1), була в 3,5 рази нижче NK-клітини від FF-тварин, як у SR-тварин, тоді як експресія гена рецептора NKG2D у NK-клітинах LF-тварин була помірною і суттєво не відрізнялася від будь-якої групи ( Малюнок 3b ).

Надлишок D (NKG2D) рецептор перфорину ( a ) і член групи 2 НК ( b ) Рідність мРНК у природних клітинах-кілерах, виділених від 21-денних свиноматок (SR, n = 7), годували сумішшю (FF, n = 4) -5) та поросят, що годували bLf (LF, n = 3). Нормалізовані значення для генів-мішеней розраховували шляхом ділення середнього значення цільової кількості на середню кількість контрольного гена. Для кожного вимірювання множину різниці обчислювали діленням нормованих цільових значень на середнє нормоване цільове значення для свиней FF. Дані виражаються як середнє значення ± SD. Різні верхні індекси (*, †, ‡) вказують на суттєві відмінності P - CD4 - CD8 +), що використовуються в цьому дослідженні для низьких рівнів CD56. Популяція CD16 + NK-клітин у людей, які виявляють цитотоксичну активність та продукцію інтерферону-γ.

Подальші експерименти, що оцінюють кілька функцій NK-клітин, з’ясують, чи мають NK-клітини поросят FF знижену ефекторну функцію, погану реакцію на стимуляцію чи активно пригнічують цитотоксичність. Наприклад, вимірювання продукції гранзиму, перфорину або інтерферону-γ у відповідь на зшивання рецепторів або застосування моноклональних антитіл до NKG2D визначатиме, чи відрізняються клітинні реакції на стимуляцію. Експресію цих білків можна виміряти за допомогою проточної цитометрії, ензимно-зв’язаного імуноферментного плямистого аналізу або імуноферментного аналізу. Вимірювання потоку кальцію після такої обробки також визначатиме, чи здатні NK-клітини поросят у різних групах лікування однаково реагувати на стимуляцію за допомогою шляхів передачі сигналу. Зниження експресії поверхні клітин Фаса, медіатора апоптозу, означало б клітини зі зниженою ефекторною здатністю. Знання конкретної стадії функції NK-клітин, на яку впливає дієта новонароджених, може дозволити розробити відповідні втручання. Отже, виходячи із зауважень, зроблених у цьому документі, цей напрямок досліджень слід продовжувати.

Загалом, дієта мала значний вплив на популяцію і активність клітин NK. Поросята, яких годували грудним молоком, мали більшу популяцію NK-клітин у крові та імунних тканинах та більшу цитотоксичну активність (PBMC) порівняно з поросятами, які були FF. Однак загальні ефекти bLf на розвиток NK-клітин у цьому дослідженні були безумовними. Харчові добавки bLf не збільшували цитотоксичність NK-клітин; проте той факт, що поросята LF мають більшу кількість NK-клітин периферичної крові з підвищеною експресією LfR, може потенційно покращити імунний захист новонародженого. Крім того, добавки bLf протягом більше 21 дня або більше можуть бути більш ефективними для посилення вродженої імунної відповіді у цих тварин, оскільки доза, використана в цьому дослідженні (1 г/л), знаходиться на нижньому кінці наявної у людини грудне молоко (

2,1 г/л). Тому необхідні майбутні дослідження, щоб визначити, чи залежить імунна регуляторна функція bLf від активності NK-клітин від певного комплексу умов, тобто від патогенного стимулу, віку чи виду. Оскільки NK-клітини є важливою першою лінією захисту від інфекції, розуміння факторів, що збільшують їх кількість та покращують здатність до вбивства, може дозволити нам краще захищати дітей FF від інфекції за допомогою дієтичних засобів.

методи

хімікати

Всі хімічні речовини були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі), якщо не зазначено інше.

Порошковий bLf (чистота 98%) був отриманий від DMV International (FrieslandCampina, Нідерланди). Загальний вміст заліза становив 120 мг/кг порошку, що представляло б 11,9% насичення, якби все залізо було зв’язане з фторопластом. bLf відновлювали у подвійно дистильованій деіонізованій воді до концентрації 100 г/л. Під час приготування рецептури 10 мл цього розчину додавали до 1 л препарату до кінцевої концентрації 1 г/л bLf.

Харчове лікування та протокол для тварин

Відбір проб

На 21 день після пологів поросятам проводили внутрішньом’язову ін’єкцію теразолу (7 мг/кг маси тіла; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA), а кров збирали внутрішньосерцевою пункцією у гепаринсодержащіе вакуумні пробірки (BD Biosciences, Сан-Хосе ), CA) для ізоляції PBMC. Потім поросят вбивали внутрішньосерцевою ін’єкцією пентобарбіталу натрію (72 мг/кг маси тіла, Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI). Після евтаназії відбирали зразки селезінки та MLN для повної ізоляції клітин.

Ізоляція PBMC

Кров розбавляли 2: 1 RPMI-1640 (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), наносили на Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) і центрифугували при 400 g протягом 40 хвилин при 20 ° C. зібрані з градієнтного інтерфейсу. Еритроцити лізували за допомогою буфера для лізису (0,15 М NH 4 Cl, 10 ммоль/л KHCO 3 та 0,1 ммоль/л Na 2 EDTA). Потім PBMC промивали три рази в промивному буфері, складеному забуференним сольовим розчином Ханка (без Ca 2+, без Mg 2+ (HBSS; Invitrogen, Gibco) з додаванням 2% BSA, 1 ммоль/л Na 2 EDTA, 50 мкг/мл гентаміцину (Invitrogen, Gibco), 1000 ОД/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину). PBMC суспендували у повному обсязі RPMI-1640 (10% FBS, 2 ммоль/л глютаміну, 50 мкг/мл гентаміцину, 1 ммоль/л пірувату натрію, 20 ммоль/л HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 ОД/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину). Кількість життєздатних клітин визначали підрахунком після фарбування трипановим синім (Invitrogen, Gibco). Потім клітини фенотипували і кількісно визначали за допомогою проточної цитометрії або використовували для виділення NK-клітин, як описано нижче.

Повна ізоляція клітин із селезінки та MLN

Зразки селезінки та MLN збирали та зберігали на льоду в буфері для збору антибіотиків до обробки. Тканини промивали три рази (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 мкг/мл гентаміцину, 1000 од/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину). Промиті тканини поміщали в С-пробірки (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) з 10 мл забуференного фізіологічного розчину Ханка і подрібнювали за допомогою тонкого MACS (Miltenyi Biotec). Отримані розчини клітин промивали через 100 мкм (BD Falcon, Сан-Хосе, Каліфорнія), а потім мембранним фільтром 40 мкм (BD Falcon). Після лізису еритроцитів, ізольовані клітини тричі промивали в промивному буфері і суспендували в повному обсязі RPMI-1640. Кількість життєздатних клітин визначали підрахунком після фарбування трипановим синім (Invitrogen, Gibco). Потім клітини фенотипували методом проточної цитометрії, як описано нижче.

Виділення NK-клітин та фенотипова ідентифікація для чистоти

Тест на цитотоксичність NK-клітин методом проточної цитометрії

Фенотипова ідентифікація одноядерних клітин з крові та клітин з MLN та селезінки

Фенотипи NK-клітин периферичної крові, MLN та селезінки контролювали за допомогою проточної цитометрії за допомогою панелі флуоресцентно мічених моноклональних антитіл. Клітини NK ідентифікували за допомогою мишачого анти-свинячого CD3: PECγ5 (Southern Biotech), мишиного проти свинячого CD4: FITC (Southern Biotech) та мишиного проти свинячого CD8: PE (Southern Biotech). Всі процедури фарбування проводили на льоду, і дотримувались особливих заходів, щоб уникнути зайвого впливу світла. Коротко кажучи, мільйон клітин на лунку блокували сумішшю 5 мкг/мл неміченого анти-CD16 (клон G7; AbD Serotec, Raleigh, NC) та 5% мишачої сироватки (Southern Biotech) для запобігання неспецифічного зв’язування антитіл з клітини. Анти-CD3, анти-CD4 та анти-CD8 антитіла додавали до лунок, інкубували протягом 15 хвилин, центрифугували, а потім супернатант відсмоктували. Клітини двічі промивали фарбувальним буфером (PBS, без Ca 2+, без Mg 2+, 0,1% азиду натрію та 1% BSA (Invitrogen, Gibco)), а потім фіксували 2% параформальдегідом. Фарбування оцінювали за допомогою проточного цитометра LSRII (BD Biosciences). Відносний відсоток популяції NK-клітин визначали за допомогою програмного забезпечення FlowJo (версія 7.0, FlowJo; TreeStar). Клітини NK були ідентифіковані як події CD3 - CD4 - CD8 + (30) і виражаються як відсоток подій CD3.

Експресія гена NK-клітини

Загальну РНК екстрагували та очищали з NK-клітин, виділених з PBMC, реагентом TRIzole (Invitrogen, Grand Island, NY) згідно з протоколом виробника. Кількісно визначали РНК спектрофотометрично, використовуючи Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Рокфорд, Іллінойс) при 260 нм. Загалом для екстракції було використано і надано 10 мільйонів NK-клітин

800 - 1000 нг/мкл РНК. Концентрацію РНК відрегулювали до 0,25 мкг/мл за допомогою води, що не містить РНК (Invitrogen), і якість РНК аналізували за допомогою біоаналізатора (модель 2100; Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія) в Центрі Кема в Університеті Іллінойсу. Усі зразки мали номер цілісності РНК> 6.

Зворотну транскрипцію проводили за допомогою термоциклера Еппендорфа (Fisher Scientific, Пітсбург, Пенсільванія). Кожна реакція містила 3 ​​мкг загальної РНК і 10 мкл суміші з набору зворотної транскрипції кДНК з високою пропускною здатністю (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія), що включає 100 ммоль/л дезоксирибонуклеотидтрифосфату (dNTP), 10X RT буфер, 10X RT випадкові праймери, Інгібітор РНКази зворотної транскрипції MultiScribe та оброблена діетилпірокарбонатом (DEPC) вода (Invitrogen) в кінцевому обсязі 20 мкл.

Кількісну ПЛР у реальному часі проводили для ITLN-2 (Ss03374218_m1), KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) та перфорину (Ss03373694_m1) та пептидилпроліл ізомерази A (Ss03392377_m1) з використанням Taqlied PCR Bios. Зразки подавали в цілому 40 циклів ампліфікації за пробіг, і інтенсивність флуоресценції визначали за допомогою машини Taqman ABI 7900 (Applied Biosystems). В якості еталонного гена використовували пептидилпролілізомеразу А (31). Результати виражали методом відносної стандартної кривої. Коротко кажучи, проводили послідовне розведення (від 1: 5 до 1:15, 625) із запасу злитої кДНК NK-клітин свині та проводили на кожній пластині. Кожну пробу запускали в трьох примірниках з праймерами для оцінки цільового гена та пептидилпроліл-ізомерази А. Нормалізовані значення для кожної мішені розраховували шляхом ділення середнього значення цільової кількості на середнє значення пептидпропроліл-ізомерази А. Різницю в кратному обчисленні обчислювали для кожного вимірювання шляхом ділення нормованих цільових значень на нормований зразок калібратора (у цьому випадку середнє значення для групи FF). Всі зразки, які тестували на статистичні відмінності, проводили на одній тарілці.

Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою узагальненої лінійної моделі Proc у межах SAS (Версія 9.2; SAS Institute, Cary, NC). Модель аналізу популяції клітин NK та експресії генів містила дієту як головний ефект. Модель цитотоксичності NK-клітин містила вплив дієти, лікування та взаємодії дієти × лікування. Нормальний розподіл даних був підтверджений тестом на нормальність в межах SAS, а число Шапіро - Вілка ≥0,75 вказувало на те, що значення розподілялися в нормі. Дані подаються як середнє значення ± SD. Порівняння з Р