реферат

Генна терапія набуватиме все більшого значення при лікуванні вроджених або набутих розладів, таких як атеросклероз та рак. Однак головні перешкоди потрібно подолати, перш ніж очікування зможуть виправдатися. Одним з найбільш важливих напрямків генної терапії є створення відповідного, точного та ефективного генного вектора, який можна безпечно вводити in vivo. 12455 У цьому дослідженні ми досліджували, чи можна використовувати сфокусоване ультразвук як фізичний інструмент для трансфекції культивованих клітин. in vitro та пухлини передміхурової залози у копенгагенських щурів in vivo .

Для цього дослідження ми обрали цільове ультразвукове дослідження синусів для локалізованої трансфекції, оскільки цей метод застосування показав найвищий рівень трансфекції з меншою цитотоксичністю in vitro. його розмір може бути змінений. 3031 В принципі, всі цільові ділянки в організмі людини, до яких можна отримати доступ через черезшкірні або ендолюмінальні клінічні ультразвукові прилади діагностики. Якщо цільовий об'єм випромінює ультразвуковий фокус, його можна обробляти ультразвуком під час багаторазового впливу. Повідомляється, що цілеспрямоване синусоїдальне ультразвукове дослідження не опосередковує трансфекцію. Особливим питанням для цієї роботи було дослідити, чи цілеспрямоване ультразвукове дослідження синусів може підвищити ефективність трансфекції ДНК-репортерної плазміди при інтенсивності та тиску ультразвуку, придатному для неінвазивних застосувань in vivo без значних побічних ефектів.

З цією метою ми вперше оптимізували акустичні параметри в експериментах з акустичною культурою клітин, щоб опосередкувати трансфекцію β-галактозидази та репортерного гена люциферази у кілька клітинних ліній (фібробласти NIH 3T3, HeLa, аденокарцинома простати R3327-AT1 та меланома людини Mewo). Потім можливість трансфекції in vivo була перевірена в одній із перевірених клітинних ліній - аденокарцинома простати R3327-AT1, яку пересадили щурам у Копенгагені. Цитохімічне фарбування β-галактозидази проводили після безпосереднього введення плазміди в пухлину та внутрішньовенного введення. Для подальшого вивчення можливостей ультразвукової трансфекції in vivo проводили ІФА для кількісного визначення рівня білка-репортера β-галактозидази в пухлинах простати після внутрішньоопухолевого та внутрішньовенного введення репортерного гена.

результат

Трансфекція in vitro

Спочатку вивчали можливості трансфекції in vitro сфокусованого ультразвуку. Флакони для клітин карциноми простати (R3327-AT1) змішували з репортерною плазмідою та піддавали дії ультразвукового поля у резервуарі з водою для забезпечення простого та оптимального ультразвукового зчеплення (рис. 1). Для визначення оптимальних умов трансфекції ультразвуком використовували 1 х 10 6 клітин раку простати (R3327-AT1) та 1 мкг репортерної плазмідної ДНК (β-галактозидази) у 500 мкл PBS у кожному 500 мл розчину. Коли зразки плазміди обробляли ультразвуком в середині фокусу звукового поля, β-галактозидаза була сильно виражена, що свідчить про успішний перенос ДНК. Ми виявили збільшення швидкості трансфекції до 220-кратної стимуляції зі збільшенням амплітуди тиску з 0,1 до 1 МПа, тоді як відсоток життєздатних клітин зменшувався з вищими амплітудами тиску до 5% при 5 МПа (рис.2). Найкраще співвідношення з точки зору високої стимуляції та високої життєздатності клітин було досягнуто при 1 МПа при 80% життєздатності. Цей тиск застосовували в наступних експериментах, оскільки час обробки ультразвуком змінювався. Зі збільшенням часу обробки ультразвуком швидкість стимуляції зросла до 3 хв, тоді як життєздатність клітин значно зменшилася (рис. 3).

vivo

Схема ультразвукового пристрою. Фокусоване ультразвук генерували за допомогою 10-сантиметрового п’єзоелектричного перетворювача, сфокусованого за допомогою полістирольної лінзи (фокусна відстань, f = 126 мм) та об’єднаного у резервуар для води на 40 л. Реакційні флакони, що містять клітини, змішані з ДНК, розміщували в еліпсоїдальному фокусі звукового поля або поза ним при кімнатній температурі. Те саме обладнання було використано для експериментів in vivo. Щурів утримували в пластиковій трубці під кутом 45 °, а нижню частину тіла занурювали у резервуар для води, щоб пухлини в стегні могли обробляти ультразвуком під водою для поліпшення ультразвукового з’єднання. Для обробки ультразвуком центр пухлин був розміщений в геометричному фокусі звукового поля.

Повнорозмірне зображення

Вплив амплітуди тиску на стимуляцію та життєздатність. Трансфекція in vitro плазміди-репортера β-галактозидази в клітинах пухлини простати Даннінга, підлінія R3327-AT1 за допомогою сфокусованого ультразвуку. Вплив амплітуди тиску на стимуляцію та життєздатність, нормалізований до контролю, визначається фарбуванням β-галактозидазою та фарбуванням трипановим синім (n = 4, середнє значення ± se). Експресію генів аналізували через 24 години після обробки ультразвуком. Стимуляцію складки розраховували за кількістю синіх клітин, поділеною на кількість синіх клітин в унесонізованих контролях. Життєздатність клітин аналізували відразу після обробки ультразвуком. Час обробки ультразвуком становив 3 хвилини, частота імпульсів - 100 Гц, тривалість імпульсу - 4 мс.

Повнорозмірне зображення

Вплив часу ультразвукової обробки на стимуляцію та життєздатність. Трансфекція in vitro плазміди-репортера β-галактозидази в клітинах пухлини передміхурової залози Dunning, підлінія R3327-AT1. Вплив часу ультразвукової обробки на стимуляцію та життєздатність нормалізували до контролю, визначеного за допомогою фарбування β-галактозидази та фарбування трипановим синім (n = 4, середнє значення ± se). Експресію генів аналізували через 24 години після обробки ультразвуком. Стимуляцію складки розраховували за кількістю синіх клітин, поділеною на кількість синіх клітин в унесонізованих контролях. Життєздатність клітин аналізували відразу після обробки ультразвуком. Амплітуда тиску становила 1 МПа, частота імпульсів - 100 Гц, тривалість імпульсу - 4 мс.

Повнорозмірне зображення

На противагу цьому ми виявили, що ні перенесення генів, ні загибель клітин не збільшувались порівняно з контрольними клітинами порівняно з контрольними клітинами, коли флакони плазмідної ДНК розміщували поза фокусом звукового поля при амплітудах тиску менше 0,1 МПа. Наступний набір параметрів був використаний у наступних експериментах (амплітуда тиску 1 МПа, частота імпульсу 100 Гц, тривалість вибуху 4 мс, час обробки ультразвуком 3 хв).

На додаток до репортерної системи β-галактозидази, ген люциферази (CMV-luci) використовувався як репортер для підтвердження незалежної цілеспрямованої ультразвукової трансфекції in vitro. Після введення гена люциферази в клітини пухлини передміхурової залози за тих самих умов, що і вище, та з використанням тієї самої процедури ультразвукової обробки, що і для репортерної системи β-галактозидази (амплітуда тиску 1 МПа, частота пульсу 100 Гц, тривалість 4 мс). час обробки ультразвуком, 10 мкг плазмідної ДНК), активність люциферази порівнювали між контролями (лише ДНК), розчинами обробленої ультразвуком ДНК та контрольованими розчинами, трансфікованими фосфатом кальцію (ДНК та фосфат кальцію, відсутність обробки ультразвуком). Активність люциферази була в 310 разів вищою після обробки ультразвуком, ніж у контролях, не підданих обробці ультразвуком (рис. 4). Активність люциферази, індукована стандартним методом трансфекції фосфату кальцію, була лише у вісім разів більшою, ніж активність люциферази, спричиненої ультразвуком.

Активність люциферази після цілеспрямованого УЗД та CaPo4. Відносна люциферазна активність клітин R3327-AT1 через 24 години після орієнтованої на сайт ультразвукової трансфекції (УЗД) геном-репортером плазміди CMV люциферази, нормалізованою до неспеціалізованого контролю. Флакони піддавали сфокусованому ультразвуку у резервуарі для води протягом 3 хвилин при кімнатній температурі (частота імпульсів 100 Гц, тривалість сплеску 4 мс, амплітуда позитивного тиску 1 МПа). Для порівняння повідомляється про ефективність трансфекції CaPo4 (n = 4, середнє значення ± se). Різниця між індукованою ультразвуком трансфекцією та контролем, а також між трансфекцією CaPo4 та ультразвуком була статистично значущою (P

США трансфекція різних клітинних ліній. Фокусована стимуляція ультразвуком різних клітинних ліній, нормалізована для кожного контролю. Фібробласти NIH 3T3, підклас пухлини передміхурової залози R3327-AT1, клітини меланоми людини (Mewo) та клітини HeLa змішували з репортерною плазмідою β-галактозидази та обробляли ультразвуком при амплітуді позитивного тиску 1 МПа при фокусному полі 100 Гц. та тривалість сплеску 4 мс протягом 3 хвилин (n = 5, середнє значення ± se).

Повнорозмірне зображення

Відповідна ефективність трансфекції in vitro становила 2% (HeLa), 4% (NIH 3T3), 12% (R3327-AT1) та 3% (Mewo) з життєздатністю клітин від 50% (Mewo) до 80%. % (R3327-AT1). Отже, у фокусі звукового поля ефективність трансфекції може бути вказана за допомогою індукованого ультразвуку.

Трансфекція in vivo в пухлину Dunning R3327-AT1

Результати гістологічного аналізу експериментів трансфекції пухлини Даннінга in vivo наведені на малюнках 6 і 7. Усі сім пухлин простати R3327-AT1, яким безпосередньо вводили ДНК та обробляли ультразвуком, виявили клітини β-галактозидази у позитивному синьому забарвленні. На противагу цьому, більшість (п’ять із семи) пухлин з внутрішньопухлинною ін’єкцією ДНК без обробки ультразвуком не показали синіх клітин, і лише дві пухлини з інтратуморальною ін’єкцією ДНК, але без обробки ультразвуком показали кілька синіх клітин. Ця різниця у частоті виявлення синіх клітин між ультразвуковими та не ультразвуковими пухлинами була статистично значущою (Р = 0,02, точний тест Фішера). Порівнюючи кількість позитивних клітин у зрізах з позитивними клітинами, ми виявили, що ультразвук викликав 10-кратне збільшення середньої кількості β-галактозидазних позитивних клітин після внутрішньопухлинної ін'єкції плазмідної ДНК порівняно з ін'єкцією лише ДНК (P

Трансфекція пухлини передміхурової залози in vivo R3327-AT1. Пухлина передміхурової залози R3327-AT1. Цитохімічне фарбування активності β-галактозидази після прямої внутрішньопухлинної ін’єкції in vivo ін’єкції плазміди-репортера β-галактозидази (10 мкг ДНК). Пухлини резецирували через 24 години після ультразвукової обробки, фіксували в забуференному формаліні і вкладали в парафін. Зрізи тканин (4-6 мкм) забарвлювали буфером X-gal і фарбували нейтральним червоним (× 160). Подібні результати були отримані для всіх семи пухлин, яким вводили ДНК та обробляли ультразвуком. Пухлини без ін'єкції ДНК та пухлини при внутрішньовенному введенні ДНК не виявили жодних синьо забарвлених клітин.

Повнорозмірне зображення

Індукована ультразвуком трансфекція пухлини передміхурової залози R3327-AT1 in vivo. Відносна кількість β-галактозидазних позитивних клітин пухлини при цитохімічному фарбуванні у контрольних тварин лише після ультразвукової обробки (УЗД), інтратуморальної ін'єкції ДНК (ІТ), інтратуморальної ін'єкції ДНК плюс УЗД (ІТ + УЗД), внутрішньовенної ін'єкції (IV) та внутрішньовенної ін'єкції плюс УЗД (iv + УЗД). Нормоване число обчислювали шляхом нормалізації до не ультразвукових пухлин, яким вводили лише розчин ДНК (тобто використовували колонки для чотирьох-шести пухлин). Різниця в кількості позитивних клітин після внутрішньопухлинної ін’єкції ДНК із ультразвуковим обробкою та без неї була статистично значущою (Р 0, 3, тест ЛСД). Ми також не змогли продемонструвати за допомогою ІФА, що сфокусоване ультразвукове дослідження призводить до значного рівня експресії білка-репортера в пухлинах після iv введення плазмідної ДНК (P> 0, 2, LSD-тест).

Ультразвукова опосередкована трансфекція in vivo

Те саме ультразвукове обладнання та резервуар для води, описані вище, використовувались для експериментів in vivo. Під час ультразвукової обробки знеболених тварин утримували у поліакриловій пластмасовій трубці, яку розміщували у резервуарі для води через ту саму систему позиціонування, яку застосовували для флаконів. Температуру води підтримували на рівні 36 ° C. Ніжка, що несе пухлину, спроектована у воду через отвір у поліакриловій стрічці і закріплена ниткою. Для обробки ультразвуком центр пухлини розташовувався в геометричному фокусі звукового поля (рис. 1) таким чином, що центральна вісь поширення ультразвуку не заважала ні частинам тіла тварини, ні пластиковій трубці на вході чи виході місце пухлини. Контрольні пухлини розташовувались на водяній бані однаково, не обробляючи ультразвуком.

Пухлинам вводили 10 мкг ДНК CMV-LacZ у 50 мкл PBS за 3 хв до обробки ультразвуком. Ін'єкцію робили в центр пухлини, а голку повільно рухали під час ін'єкції, щоб забезпечити широке розподіл та уникнути внутрішньопухлинної кровотечі або механічних змін пухлини. Щоб уникнути витоку розчину ДНК через канюляцію внаслідок тургору пухлини, ми протестували на підставі найкращого способу внутрішньопухлинної ін’єкції. Ми виявили, що якщо голка залишається нерухомою протягом 2-3 хв до видалення голки, розчин залишається в пухлині. Для внутрішньовенного введення 100 мкг ДНК CMV-LacZ у 500 мкл PBS вводили у хвостову вену тварини за 3 хв до обробки ультразвуком.

Для цитохімічного аналізу пухлини резекували через 24 години після ультразвукової обробки, фіксували в забуференному формаліні та вбудовували в парафін. Зрізи тканин (4–6 мкм) забарвлювали буфером X-gal і фарбували нейтральним червоним. Стимуляцію оцінювали шляхом підрахунку синіх клітин на гістологічних зрізах за допомогою сітки. Порівнювали відповідні репрезентативні площі 5 мм 2, де можна було виявити найбільшу кількість синіх клітин на окремому зрізі. За допомогою цитохімічного фарбування виявлено відмінності в кількості трансфікованих клітин та місці та геометрії області експресії гена.

Три додаткові пухлини лише обробляли ультразвуком, резекували через 72 год після лікування і фарбували гематоксилін-еозином (ВІН).

Концентрацію білка бета-галактозидази визначали кількісно за допомогою ІФА (3 Prime-5 Prime, Boulder, CO, USA) згідно з інструкціями виробника. Використовуючи ту саму біологічну модель, умови ультразвуку та застосування плазміди, що і для гістології, було проведено інший набір експериментів. Пухлини збирали через 24 години після обробки ультразвуком і заморожували в рідкому азоті. Для порівняння у цих тварин також аналізували шкіру, що покриває пухлину, а також ділянку стегнового м’яза, що прилягає до пухлини. Тканини подрібнювали в порошок, а лізати клітин готували з використанням буфера для лізису (10 мМ Tris-Cl, рН 8, 1 м М PMFS, 1 мкг/мл апротиніну). Забруднення тканин гранулювали центрифугуванням при 14000 г, і загальну концентрацію білка визначали, використовуючи аналіз Бредфорда (BioRad Laboratories, Річмонд, Каліфорнія, США). Значення поглинання визначали кількісно за допомогою зчитувача пластин ELISA при довжині хвилі 405 нм. Кількість білка β-галактозидази визначали як нг β-галактозидази на міліграм білка. Всі зразки тканини вимірювали в трьох примірниках.

Статистичний аналіз

Точний тест Фішера використовували для аналізу пропорцій, а тест t Стьюдента - для порівняння середніх значень. Для багаторазових порівнянь використовували дисперсійний аналіз (ANOVA) із методом найменш значущої різниці Фішера (LSD). Загалом, обсяг зразків in vitro становив від чотирьох до п’яти зразків для кожного стану, а обсяг зразків in vivo - чотири-сім пухлин на кожен стан. Всі аналізи проводились за допомогою програми Statistica 5.0 43, і всі тести були двосторонніми.

Дякую

Ми хочемо подякувати Юргену Дженне за підтримку у фізичних ультразвукових вимірах, Пітеру Пешке за надання клітин AT1 та підтримку в гістологічному аналізі, Клаусу Веберу за надання клітин Мево та Юргену Дебусу за підтримку досліджень. Ми дякуємо Олександрі Тітце за чудову технічну допомогу в експериментах на тваринах. Ми вдячні Томасу Вірту за обговорення проекту та надання репортерських конструкцій та клітин NIH 3T3 та HeLa. Ця робота була частково підтримана Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 798/1-1).