предметів

реферат

Цукровий діабет 2 типу - це хронічне порушення обміну речовин, яке головним чином спричинене резистентністю до інсуліну, головним фактором якого є ожиріння. Рівні експресії рецепторів зв’язаних з білками-сиротами (GPCR), GPR21, продемонстрували тенденцію до значного збільшення вмісту епідидимальних жирових прокладок у мишей з високим вмістом жиру та високим вмістом жиру (HFHS). Щоб отримати подальше розуміння потенційної ролі, яку ця нова мішень може відіграти у розвитку діабету 2 типу, пов’язаного з ожирінням, досліджено здатність сигналізації рецепторів. Дослідження надмірної експресії в клітинах HEK293T показали, що GPR21 є конститутивно активним рецептором, який зв'язується з білками G qq G-типу, що призводить до активації мітоген-активованих протеїнкіназ (MAPK). Надмірна експресія GPR21 in vitro також значно послабила передачу сигналів про інсулін. Цікаво, що ефект GPR21 на MAPK та інсулінову сигналізацію зменшувався у присутності сироватки, що призводило до можливості природного інгібуючого ліганду. Гомологічне моделювання та дослідження стикування лігандів призвели до ідентифікації нової сполуки, яка інгібувала активність GPR21. Його ефекти пропонують протидіабетичну фармакологічну стратегію, оскільки було показано, що він протидіє дії GPR21 на сигнальний шлях інсуліну.

Діабет 2 типу в основному спричинений інсулінорезистентним системним станом, спричиненим збільшенням в'язкої жирової тканини, що викликає хронічне запалення низького ступеня тяжкості, яке негативно впливає на сигнальний шлях інсуліну 1, 2. Зростаюча частота розвитку діабету 2 типу, разом з обмеженнями нинішніх схем лікування, вимагає інноваційних, ефективних стратегій запобігання розвитку та прогресуванню цієї хвороби. G-білкові рецептори (GPCR), найбільша надсімейство білка в геномі, є багатим джерелом лікарських мішеней, оскільки вони легко передають зовнішні сигнали у внутрішнє середовище клітини: приблизно 30-40% проданих ліків націлено на ці універсальні рецептори 3 .

Ми спостерігали збільшення рівня експресії GPCR, GPR21, в жировій тканині мишей з високим вмістом цукру (HFHS). Незважаючи на те, що це збільшення не досягло статистично значущого рівня, GPR21 може представляти новий засіб, за допомогою якого міг би бути націлений фенотип цільового типу 2, оскільки цей GPCR був розроблений для створення пари з білками G q q підтипу, Gaq10 та Ga15/16 11. Досягнення досліджень гомологічного моделювання та стикування лігандів значно полегшили розробку цілеспрямованих методів лікування сиріт GPCR 12. Оскільки структура GPR21 залишається невідомою, ці методи використовувались для виявлення потенційних малих молекул, здатних зв'язувати та регулювати ефекти цього рецептора.

Ця робота забезпечує аналіз GPR21-індукованої передачі сигналу, який забезпечує огляд механізмів, за допомогою яких цей рецептор може діяти на діабетичний фенотип типу 2, і, отже, може представляти можливість для нової терапевтичної стратегії. Спостережувана конститутивна активність GPR21, яка сприяє активації MAPK і негативно впливає на сигнальний шлях інсуліну, може регулюватися природним лігандом, присутнім у сироватці крові. Крім того, було встановлено, що нова сполука, призначена для зв'язування з GPR21, захищає від спостережуваних ефектів рецептора на сигнальний шлях інсуліну.

результат

GPR21 є конститутивно активним рецепторним сигналом через Ga15/16

регулювання

Епідидимальні жирові подушечки контролю та мишей C57BL/6J, які годували HFHS, лізували, білки розділяли SDS-PAGE та експресію ( a ) GPR21 a ( b ) маркера макрофага, F4/80, оцінений Вестерн-блот. Репрезентативні вестерн-плями показані разом із відносною щільністю, визначеною за допомогою програмного забезпечення Image J, представленою як середнє значення ± SEM, n = 9. Значне збільшення експресії F4/80 спостерігалося за допомогою неспареного t-критерію Стьюдента при

Повнорозмірне зображення

Оскільки надмірна експресія GPR21 спричинила значне збільшення фосфорилювання JNK, оцінювали вплив рецептора на сигнальний шлях інсуліну. Клітини HEK293T, що надмірно експресують GPR21, не реагували на індуковану інсуліном стимуляцію їх рецептора, що в результаті незначно зменшилось у присутності сироватки (рис. 2д). За течією шляху GPR21 надмірна експресія запобігала фосфорилюванню IRS1, Akt та AS160 у присутності та відсутності інсуліну. Цей результат знову знизився, коли клітини інкубували із сироваткосодержащим середовищем. Пов'язаний результат спостерігався, коли GPR21 асоціювався з Ga 15/16 (рис. 2е), хоча ефект сироватки був слабким. Через ослаблений сигнальний шлях інсуліну GPR21 також спричинив значне зменшення споживання глюкози, яке частково було виділено у присутності сироватки (рис. 2g). При спільній експресії з G15 15/16 спостерігалася подібна тенденція (рис. 2h). Вплив GPR21 на сигнальний шлях інсуліну не обмежується клітинами HEK293T, оскільки цей ефект також може спостерігатися в клітинах СНО, що надмірно експресують рецептор (див. Додаткову схему S1).

Нова сполука захищає від впливу GPR21

Ця робота демонструє потенційну роль, яку GPR21 може зіграти у розвитку діабету 2 типу (рис. 4). Індукований ожирінням діабет 2 типу може бути пов'язаний з порушенням регуляції GPR21 через посилення експресії рецепторів, збільшення ендогенного агоніста або зниження зворотного агоніста, що призводить до стимуляції MAPK, які сприяють гальмівним ефектам GPR21. Орієнтація на GPR21 з використанням зворотного агоніста, такого як визначений у цьому дослідженні, може обмежити деякі з багатьох аспектів, що сприяють розвитку інсулінорезистентності та діабету 2 типу.

Конститутивно активний GPR21 отримує та активує G15 15/16, що полегшує гідроліз PIP 2 до DAG та IP3 за допомогою PLC. І DAG, і IP 3 активують PKC, який подає сигнал і активує каскад MAPK. MAPK JNK відіграє ключову роль у розвитку інсулінорезистентності, оскільки сприяє фосфорилюванню ключового компонента сигнального каскаду інсуліну, IRS1, в Ser 307, тим самим запобігаючи індуковане інсуліном фосфорилювання тирозину. Індукована GPR21 активація MAPK може сприяти розвитку діабету 2 типу. Через потенціал природного зворотного агоніста в сироватці, вважається, що передача сигналу GPR21 жорстко регулюється в нормальних фізіологічних умовах. Однак при ожирінні підвищена активність GPR21 може стати шкідливою, потенційно сприяючи розвитку інсулінорезистентності.

Повнорозмірне зображення

методи

Самці мишей C57BL/6J у віці 4 тижнів (n = 18, надані Charles River, Calco, Lecco, Італія) були поміщені в середовище з контрольованою температурою з 12-годинним циклом світло/темрява. Тварин витримували гранульовану дієту протягом 1 тижня, а потім випадковим чином розділили на дві групи: нормальний раціон (контроль, n = 9) та дієта з високим вмістом цукру та високим вмістом цукру (HFHS, n = 9) протягом 16 тижнів. Дієта HFHS містила 45% ккал жиру, 35% ккал вуглеводів і 20% ккал білка (D12451, ssniff Spezialdiäten GmbH, Німеччина). Процедури, використані у цьому дослідженні, були затверджені Комітетом з використання та догляду за тваринами Туринського університету, а згодом Комітетом з етики Національного університету Ірландії, Мейнут (BSRESC-2014-008). Протоколи відповідали Європейській директиві 2010/63/ЄС про захист тварин, що використовуються в наукових цілях.

Культура клітин, трансфекція та лікування

Клітини HEK293T підтримували в повному середовищі (модифіковане Дульбекко середовище з високим вмістом глюкози Eagle (DMEM), що містить 2 мМ L-глутаміну і 100 мкг/мл пеніцилін-стрептоміцину), доповнене 10% (об/об) фетальної бичачої сироватки (FBS) (Sigma) при 37 ° C у зволоженій атмосфері 5% CO 2. Клітини трансфікували 2 мкг людського GPR21, що містив мітку myc, включену в С-кінець або порожній вектор, pCMV6-Entry (OriGene Technologies), за допомогою Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) згідно з протоколами виробника. При ко-трансфекції кДНК, що відповідає α-субодиницям G-білка, Gaq, Ga15/16 та Ga14 (Центр ресурсів кДНК), використовували по 1 мкг кожної плазміди. Клітини інкубували протягом 24 годин при 37 ° C, щоб забезпечити включення плазмідної ДНК. Для визначення впливу сироватки на активність GPR21 клітини інкубували протягом додаткових 24 годин зі свіжим повноцінним середовищем ± 10% (об/об) FBS. Обробку сполуками (GF109203X, U73122 та SP600125, Sigma) проводили у повному середовищі без сироватки. Для визначення впливу GPR21 на інсулінову сигналізацію клітини HEK293T стимулювали 100 нМ інсуліном (Sigma) у буфері Рігера Рінгера (KRB); 136 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 4,7 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4, 1 мМ CaCl 2, 4,0 мМ Na 2 HPO 4, 0,95 мМ NaH 2 PO 4, pH 7,4, що містить 5 мМ глюкози протягом 1 години при 37 ° C,

Час однорідної флуоресценції інозитолфосфату (IP-one) (HTRF)

Рівні клітинного IP 1 вимірювали за допомогою набору для аналізу IP-one HTRF (Cisbio) 13. Коротко кажучи, субконфлюентні клітини відокремлювали від посудини для культури клітин шляхом трипсинізації та ресуспендували у відповідному обсязі буфера стимуляції аналізу (10 мМ HEPES, 1 мМ CaCl 2, 0,5 мМ MgCl 2, 4,2 мМ KCl, 146 мМ NaCl, 5,5 мМ глюкози) . 50 мМ LiCl, рН 7,4) нагрівають до 37 ° С до концентрації 6 х 10 6 клітин/мл. Суспензію клітин додавали до білої пластинки на половину об'єму 384 лунки (Greiner) разом із досліджуваним з'єднанням та інкубували при 37 ° C протягом 2 годин. Буфер лізису IP-one, що містить 5% кон'югату IP-one-d2, додавали у відповідні лунки, а потім 5% кон'югату криптату Tb анти-IP-one. Зразки інкубували в темряві протягом 1 години при кімнатній температурі. Платівку зчитували на лабораторній тарілці BMG з пластинами, збудженими при 340 нм і випромінюваних при 615 нм і 665 нм. Коефіцієнти перенесення енергії флуоресцентного резонансу (FRET) (665 нм/615 нм) перетворювали в концентрації IP 1 шляхом інтерполяції значень із стандартної кривої IP 1. .

Приготування лізатів та Вестерн-блот-аналіз

Заморожені жирові прокладки мишей епідидиму гомогенізували в крижаному буфері для лізису (50 мМ HEPES рН 7,5, 150 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 1 мМ EGTA, 1,5 мМ MgCl 2, 2 мМ Na 3 VO 4, 10% (об./Об.) ). об.) гліцерин, мМ Na 4 P 2 O 7, 1 мМ PMSF, 1X коктейль інгібітора протеази SigmaFAST і 1% (об./об.) Triton x-100) у співвідношенні 1: 5 (w: v) за допомогою ручного базового гомогенізатора T10 (IKA). Клітини тричі промивали крижаним сольовим розчином, забуференним фосфатом (PBS), потім ресуспендували в буфері для лізису. Сирі екстракти інкубували протягом 1 години при 4 ° С при перемішуванні. Зразки центрифугували при 17000 x g протягом 10 хвилин при 4 ° C, нерозчинні гранули видаляли і концентрацію білка визначали за допомогою білкового аналізу Пірса (PN22660).

Лізати з однаковою концентрацією білка відокремлювали SDS-PAGE, переносили на PVDF-мембрану і блокували на 1 годину в буферному сольовому розчині (150 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,6) з 0,1% (об/об) Твін -20, що містить 5% (мас./Об.) Бичачого сироваткового альбуміну (BSA). Мембрани інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 ° C, а потім вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону, протягом 2 годин при кімнатній температурі. Білкові смуги візуалізували на рентгенівській плівці з підвищеною хемілюмінесценцією (Roche). Імунодетекція була досягнута за допомогою наступних антитіл від Cell Signaling Technology; фосфо-ПКС Thr 505 (9374), фосфо-Erk Thr 202/Tyr 204 (4370), Erk (4695), фосфо-p38 Thr 180/Tyr 182 (4511), p38 (9212), фосфо-JNK Thr 183/Tyr 185 (4668), JNK (9258), фосфо-інсуліновий рецептор p Tyr 1150/1151 (3024), IRS1 (3407), phospho-Akt Ser 473 (9271), Akt (9272), phospho-AS160 Thr 642 (8881), фосфо-AS160 Ser 588 (8730), AS160 (2670) та myc (2276). Фосфо-IRS1 Tyr 612 (44-816G) постачався Life Technologies, а рецептори інсуліну β (ab69508), GPR21 (ab139654), F4/80 (ab74383) та β-актин (ab8226) були придбані у Abcam.

Поглинання 2-дезоксиглюкози

Поглинання глюкози вимірювали згідно з Yun та співавт. 18, із модифікаціями. Трансфіковані клітини HEK293T промивали один раз KRB, нагрітим до 37 ° C, потім інкубували з 1 мкКі/мл [3 H] -2-дезоксиглюкози (PerkinElmer, NET328A001MC), приготовленого в KRB при 37 ° C протягом 10 хвилин. Для завершення аналізу клітини тричі промивали крижаним KRB і лізували в 0,1% (мас./Об.) SDS при 37 ° C протягом 30 хвилин. Клітинні лізати розводили 1: 4 у β-сцинтиляційній рідині (Beta-Plate Scint, PerkinElmer). Включення [3H] -2-дезоксиглюкози кількісно визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника Wallac 1450 Microbeta (PerkinElmer), виражаючи результати в кількості в хвилину (CPM). Загальний вміст білка визначали за допомогою процедури біцинхонінової кислоти 19, щоб визначити результати як CPM/мг.

Моделювання та стикування гомологічних лігандів GPR21

Внутрішня структурна модель GPR21 була побудована за допомогою програмного забезпечення Modeller, вбудованого в Biovia Discovery Studio 20. Було побудовано порівняння послідовностей між амінокислотною послідовністю шаблонів GPCR (2RH1 21, 4GBR 22) з hGPR21 (код приєднання Swissprot Q99679) та перевірено вручну для підтвердження правильного вирівнювання збережених залишків 23. За допомогою вирівнювання було створено 1000 різних моделей з подальшим протоколом уточнення, застосованим до областей петель 24, 25. Дисульфідні зв’язки утворилися між Cys 102 і Cys181. Остаточна модель була обрана за допомогою цільової оцінки Modeller та підбору інструментів оцінки білка (//services.mbi.ucla.edu/SAVES/) 26, 27 .

Використовуючи цю розроблену білкову модель, були впроваджені процеси віртуального скринінгу для вивчення великих баз даних баз даних (наприклад, Specs, www.specs.net) in silico за допомогою молекулярних стикувальних досліджень (OpenEye, Fred 28, 29, 30). Молекули стандартизували, таутомери та стереоізомери розраховували за допомогою пілотного трубопроводу Biovia 20. Конформери були створені за допомогою Omega 31, 32, 33 від Openeye перед стикуванням із використанням стандартних параметрів з Fred 29 та оцінкою за допомогою функції підрахунку chemgauss3. З наведеного списку 11 сполук було замовлено для експериментальної перевірки.

Аналіз даних

Дані представлені як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення (SEM). Непарний t-тест Стьюдента використовували для визначення значущості між групами. Односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з пост-hoc тестом Тукі використовували для визначення значимості між трьома або більше групами. Значимість була вказана як с