індукована

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Індукція виразу gbb імітує HFD-фенотипи в Дрозофіла
  • Інгібування передачі сигналів Gbb рятує ожиріння, спричинене ВЧР, та діабетичні фенотипи
  • дрібниці є ціллю сигналізації Gbb нижче за течією
  • дрібниці негативно регулює передачу сигналів про інсулін
  • гальмування дрібниці пригнічує індуковане ожирінням gbb і діабетичний фенотип
  • Обговорення
  • Матеріали і методи
  • Drosophila melanogaster запаси
  • Культура клітин, стимуляція та трансфекція.
  • HFD та потужність
  • Вимірювання рівня ТГ тіла
  • Вимірювання рівня трегалози/глюкози в гемолімфі
  • Очищення РНК та кількісний RT-PCR аналіз
  • Культура ex vivo жирових тіл дорослих
  • Вестерн-блот і імунозабарвлення
  • Чіп
  • Аналіз репортера люциферази в клітинах Дрозофіла S2
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

Резюме

Вступ

У мух, яких годували HFD, спостерігався ненормальний рівень глюкози та ліпідів та резистентність до інсуліну, подібні до тих, що спостерігались у ожирілих ссавців. Індукована HFD інсулінорезистентність була опосередкована активністю племінного шляху Gbb у жировому тілі. Отже, цілеспрямоване інгібування передачі племінних сигналів Gbb представляє нову терапевтичну стратегію для лікування ожиріння та пов’язаних із цим метаболічних захворювань.

Результати

Індукція експресії gbb імітує фенотипи HFD у дрозофіли

На 14 день HFD ми вимірювали рівні експресії семи лігандів надродини TGF-β у жировому тілі дорослої мухи. З факторів, які ми перевірили, лише експресія gbb суттєво збільшилася при годуванні HFD (рис. 1А), особливо в жировому тілі (рис. S2A). Потім ми дослідили, чи може ГББ змінити рівень ТГ в жировому організмі та трегалозу/глюкозу в гемолімфі. Надмірна експресія gbb у жировому організмі дорослого (DCG> gbb) збільшила рівень TG та трегалози/глюкози порівняно з показниками контрольних мух (DCG-Gal4/+) (рис. 1B). Однак надмірна експресія gbb в кишечнику (NP3084> gbb) або в м'язах (MHC> gbb) не змінила рівень TG (рис. S2B). Крім того, рівень pAKT був значно знижений у вмісті gbb, одержуваного жиром (DCG> gbb), але не в gbb кишечника або м’язів (рис. S2C).

Надмірна експресія gbb у жировому тілі дорослого (pS106 GS> gbb + RU) суттєво збільшила експресію Dilp2 та дещо збільшила експресію Dilp3 та Dilp5 по відношенню до рівнів у елементах управління -RU (рис. 1E). Щоб визначити, чи регулює gbb сигналізацію про інсулін, ми розібрали жирне тіло дорослих мух pS106 GS> gbb + RU або -RU та обробили їх інсуліном ex vivo (рис. S2E). У контролях -RU лікування ex vivo інсуліном підвищувало рівень pAKT щодо рівня необроблених зразків. Навпаки, у зразках, отриманих від мух + RU, які надмірно експресували gbb в організмі дорослого жиру, лікування інсуліном ex vivo не підвищувало рівень pAKT (рис. 1F).

Для подальшого дослідження регуляції передачі сигналів інсуліну за допомогою gbb ми дослідили субклітинну локалізацію dFOXO в жирових тілах личинок за допомогою специфічного контролера жирового тіла DCG-Gal4. У цих експериментах розсічені жирові тіла позбавляли сироватки і обробляли людським інсуліном ex vivo. У контролі голодування DCG-Gal4 та жирових тілах DCG> gbb dFOXO локалізувався переважно в ядрах (рис. 1G, I). Після стимуляції інсуліном майже весь білок dFOXO переміщувався в цитоплазму в контрольних жирових тілах DCG-Gal4 (рис. 1Н), тоді як у жирових тілах DCG> gbb більшість білка dFOXO все ще знаходилася в ядрах (рис. 1J). Ці результати вказують на те, що надмірна експресія gbb в жировому тілі гальмує передачу інсуліну, що призводить до інсулінорезистентного фенотипу, подібного до того, що спостерігається при тривалому годуванні HFD.

Інгібування передачі сигналів Gbb рятує ожиріння, спричинене ВЧР, та діабетичні фенотипи

( ДО ) Рівні тригліцеридів та трегалози/глюкози в pS106 GS> trb + RU зросли порівняно з показниками контролів −RU. ( B ) У стані HFD падіння рівня trb в жировому організмі пригнічувало підвищений рівень тригліцеридів та трегалози/глюкози. ( C., D ) Елімінація trb в жировому організмі, що надмірно експресує gbb (pS106 GS> gbb + trb RNAi + RU), пригнічувала підвищений рівень тригліцеридів та трегалози/глюкози, який спостерігався при pS106 GS> gbb + RU. Дані представлені як середнє значення ± sem щонайменше трьох незалежних експериментів. * P 4, 5, що в свою чергу викликає вторинні захворювання, такі як резистентність до інсуліну 6. У цьому дослідженні ми демонструємо, що індуковане HFD ожиріння викликає передачу сигналу TGF-β, який знижує рівень сигналів інсуліну в жировому тілі. Ми також демонструємо роль дрібниць, нової мішені сигналізації TGF-β/Gbb, у розвитку інсулінорезистентності.

Моделі дрозофіли використовувались у кількох недавніх дослідженнях ожиріння, спричиненого дієтою, інсулінорезистентності, гіперглікемії та гіперінсулінемії 29, 30, 31, 32. У личинок дрозофіли дієта з високим вмістом цукру викликає діабетичні фенотипи 2 типу, які включають гіперглікемію, високий рівень ТГ та резистентність до інсуліну 31. Подібним чином, у дорослих мух годування HFD також індукує високий рівень ТГ та змінений метаболізм глюкози, а у ссавців викликає серцеві дисфункції, такі як діабетична кардіоміопатія 29. У цьому дослідженні ми встановили модель дрозофіли індукованої ожирінням резистентності до інсуліну, яка має вражаючі паралелі із системою ссавців, і використовували її для спостереження та дослідження розвитку інсулінорезистентності в умовах хронічного переїдання. Крім того, для детального вивчення фенотипу інсулінорезистентності дрозофіли ми розробили систему культури ex vivo (рис. S2E).

Коли ми годували дорослих мух HFD, їх короткострокові та довгострокові метаболічні реакції були різними: наприклад, експресія та секреція Dilp2 збільшувалася HFD в короткостроковій перспективі, але зменшувалася HFD в довгостроковій перспективі. Сигналізація про інсулін, яка була проаналізована шляхом моніторингу активації pAKT та експресії цільових генів dFOXO d4E-BP та dInR, активувалась у HFD короткостроково, але не довгостроково, тоді як рівні TG та трегалози/глюкози в гемолімфі були збільшені в довгостроковій перспективі. Термін HFD (рисунок S1). Оскільки ці патологічні фенотипи у мух були дуже схожі на фенотипи, асоційовані з інсулінорезистентним діабетом у ссавців, ми робимо висновок, що дорослі мухи з HFD можуть бути використані як модель для діабету 2 типу.

Підводячи підсумок, ми створили модель резистентності до інсуліну дрозофіли та продемонстрували, що передача сигналу Gbb в жировому тілі відіграє вирішальну роль у опосередкованій ожирінням резистентності до інсуліну, регулюючи експресію племен. Ці результати дають інформацію про роль сигналізації Gbb/TGF-β у метаболічних захворюваннях і припускають, що цей шлях представляє перспективну терапевтичну мішень для лікування ожиріння та діабету.

Матеріали і методи

Drosophila melanogaster запаси

Drosophila melanogaster вирощували та витримували при 25 ° C у ЛОР-умовах, що містили 38% кукурудзяного борошна, 20% дріжджів, 5% цукру та 2% агару. w 1118 мух було отримано з Блумінгтонського фондового центру, pS106 GS -Gal4 від доктора М. Татара, DCG-Gal4 від доктора Дж. Граффа, UAS-gbb, UAS-dpp, UAS-UAS-dActβ та UAS-пунт DN з доктора М. О'Коннера та трибун UAS доктора М. Мілана. Ми також отримали лінії UAS-gbb RNAi, UAS-dMad RNAi та UAS-tribbles RNAi від Віденського ресурсного центру дрозофіли. Для експресії pS106 GS -Gal4 дорослих мух культивували на дієті на основі агару, доповненій 200 мкМ RU486 (Sigma).

Культура клітин, стимуляція та трансфекція.

Клітини дрозофіли S2, придбані у Invitrogen, витримували при температурі 26 ° C у середовищі Шнайдера з додаванням 10% телячої сироватки. Клітини HepG2 культивували в 4,5 г/л глюкози в модифікованому середовищі орела Дульбекко (DMEM), доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою, 2% L-глутаміном, 100 мО/мл пеніциліну та 100% стрептоміцином/мл в атмосфері 5% CO2 при 37 ° С. Культурне середовище змінювали кожні 2-3 дні. Перед обробкою пептидами клітини голодували протягом 8 год у безсироватковому середовищі, що містить 0,5% BSA, і попередньо обробляли хімічним інгібітором або носієм. В цих експериментах використовували інгібітор кінази TGF-β та TGF-β RI кінази II (10 мМ, Calbiochem). Для трансфекції клітини вирощували в ростовому середовищі без антибіотиків і трансфікували невеликою заважаючою РНК (siРНК) за допомогою Xtreme GENE HP (Roche). Для надмірної експресії gbb кДНК gbb у повному розмірі клонували у вектор pAc5 (Invitrogen).

HFD та потужність

HFD готували додаванням 20% (об./Об.) Кокосової олії до НИЗ; Ці співвідношення використовувались у всіх експериментах з HFD. HFD вводили чоловікам-мухам, зібраним у віці 3–5 днів.

Вимірювання рівня ТГ тіла

Тридцять тіл дорослих мух було зібрано та гомогенізовано, а рівні ТГ вимірювали за допомогою набору для визначення тригліцеридів (Sigma). Рівень TG нормалізувався до загального рівня білка.

Вимірювання рівня трегалози/глюкози в гемолімфі

Гемолімфу збирали у 20 мух і вимірювали концентрації трегалози/глюкози, як описано раніше 40 .

Очищення РНК та кількісний RT-PCR аналіз

Жирові тіла відбирали у 20 мух для приготування РНК. Загальну екстракцію РНК та кількісну RT-PCR проводили, як описано раніше 23. Рівні мРНК виражали як кратну зміну щодо відповідного рівня мРНК rp49, використовуваного як внутрішній контроль нормалізації. Для аналізу даних використовували метод порівняльного порогу циклу (Ct) (User Bulletin 2, Applied Biosystems). Праймери, використані в цьому дослідженні, перелічені в додатковій таблиці 1.

Культура ex vivo жирових тіл дорослих

Тіла дорослих жирів розтинали в середовищі Шнайдера, голодували протягом 8 год у безсироватковому середовищі, що містить 0,5% BSA, та інкубували протягом 1 години в середовищі Шнайдера, що містить людський інсулін (100 нМ, GIBCO).

Вестерн-блот і імунозабарвлення

Загальний білок із дорослих жирових тіл виділяли в буфер гомогенату дрозофіли (10 мМ HEPES, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 5 мМ DTT, 0,1% Triton X-100, 10% гліцерину та інгібіторний коктейль протеази [Sigma]). Вестерн-блотування проводили, як описано раніше 22. Первинні антитіла до фосфо-AKT та dAKT (обидва використовували при 1: 1000) отримували за допомогою Cell Signaling, а кон’юговані з пероксидазою хрону вторинні антитіла IgG проти кролика (1: 2000) від Santa Cruz Biotechnology. Імунозабарвлення проводили, як описано вище 41, з первинним антитілом dFOXO (1: 200; подарунок доктора М. Татара) та вторинним анти-кролячим антитілом IgG Alexa 488 (1: 200, молекулярні зонди).

Клітини фіксували в 0,5% формальдегіді протягом 15 хвилин. Аналіз ЧІП проводили, як описано 23. Після виділення ядер та гідроакустичного хроматину аліквоту ДНК видаляли як контроль над входом, а решту інкубували з нормальним мишачим IgG (2 мкг, Санта-Крус Біотехнологія) або мишачим анти-dMad (2 мкг, Санта-Крус Біотехнологія) Традиційний ПЛР та qPCR проводили з використанням вхідної ДНК та імунопреципітованої ДНК. Праймери, використані в цьому дослідженні, перелічені в додатковій таблиці 2.

Аналіз репортера люциферази в клітинах дрозофіли S2

Для аналізів на люциферазу їх ампліфікували за допомогою ПЛР-ПЛР, субклонували у репортерний вектор люциферази pGL3 (Promega) та 1,4 кб геномної ДНК перед Drosophila trb (+60 до -1346) та 1,1 кб (+60 до -11054) ). trb1.4kb та pGL3-trb1.1kb. pGL3-trb1.4KbΔMbs, конструкція делеції передбачуваної послідовності Mad-переходу (GACATCCGTCTG) у pGL3-trb1.4Kb, була створена шляхом ПЛР з накладанням на розширення з використанням праймерів, які сидять на фланкуючих послідовностях 42. Ці конструкції ДНК та вектор експресії білка pAc5.1A-gbb або pAc5.1A трансфікували в клітини дрозофіли S2 за допомогою Xtreme GENE HP (Roche). Через 48 год клітини збирали та вимірювали активність люциферази, використовуючи систему аналізу репортерів люциферази (Promega), згідно з інструкціями виробника. Випробування повторювали тричі. Праймери, використані в цьому дослідженні, перелічені в додатковій таблиці 2.

статистичний аналіз

Кожен експеримент повторювали принаймні три рази, і дані представляли як середнє значення ± sem t-тесту Стьюдента використовували для статистичного аналізу, а P