метформіну

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Комбінована терапія з метформіном та ліраглутидом є більш ефективною, ніж одноразова терапія, для захисту від ендотеліальної дисфункції, спричиненої пальмітиновою кислотою (ПА).
  • Вплив комбінованої терапії метформіном та ліраглутидом на функцію ендотелію судин у мишей ApoE -/-
  • Індукована метформіном регуляція рівнів рецепторів GLP-1 (GLP-1R) та фосфорилювання протеїнкінази А (PKA) можуть сприяти синергетичним захисним ефектам комбінованої терапії.
  • Метформін відновлює рівні GLP-1R з порушеннями PA і фосфорилювання PKA в HUVEC за допомогою AMP-активованої протеїнкінази (AMPK).
  • обговорення
  • Матеріали і методи
  • реагенти
  • Навчання в пробірці
  • Підготовка ПА
  • Культура клітин та лікування
  • Втручання РНК
  • Виявлення внутрішньоклітинних АФК
  • Виявлення НІ супернатанту
  • Вестерн-блот
  • Навчання у природніх умовах
  • звір
  • Підготовка аортальних кілець та вимірювання розширення судин
  • ВІН та імунохімічне фарбування
  • Статистичний аналіз
  • Детальніше
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

предметів

  • Діабетичні ускладнення
  • Гормональні рецептори

реферат

Когортні дослідження та мета-аналізи вказують на те, що діабет 2 типу тісно пов'язаний із підвищеним ризиком розвитку багатьох атеросклеротичних серцево-судинних захворювань 1, 2. Хоча точні механізми, що відповідають за прискорений атеросклероз, до кінця не вивчені, показано, що дисфункція ендотелію є однією з найперших подій у розвитку атеросклерозу. Ендотеліальна дисфункція характеризується зниженим синтезом оксиду азоту (NO) та/або біодоступністю в периендотеліальному середовищі, де NO відповідає за підтримку цілісності судинної тканини 3 .

Метформін - найчастіше призначається препарат для лікування гіперглікемії у пацієнтів з діабетом 2 типу. Клінічні дослідження продемонстрували сприятливий вплив метформіну на серцево-судинну систему 4, 5, 6. Крім того, метформін може безпосередньо захищати ендотеліальні клітини від пошкодження, що виходить за межі його ефектів зниження глюкози 7, 8. Засоби, подібні до глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP-1) (включаючи аналоги GLP-1 та інгібітори дипептидилпептидази 4), нещодавно були затверджені як нові терапевтичні варіанти для пацієнтів із діабетом 2 типу на основі доказів того, що GLP-1 може стимулювати інсулінозалежний секреція з глюкози з β-клітин підшлункової залози. Окрім ефекту зниження рівня глюкози, GLP-1 має і інші позашлункові ефекти. Недавнє дослідження LEADER (Ліраглутидний ефект та дію при цукровому діабеті: оцінка серцево-судинних результатів) показує, що лікування аналогом ліраглутиду та аналогом GLP-1 зменшує серцево-судинні події та смерть у пацієнтів із діабетом 2 типу 9. Важливо, що ендотелій судин відіграє важливу роль у підтримці серцево-судинної функції 10. Нові дані свідчать про те, що GLP-1 та його аналоги мають прямий захисний ефект на ендотелій судин 11 .

У клінічному дослідженні комбінована терапія з ліраглутидом та метформіном показала значно вищу втрату ваги та нижчу частоту гіпоглікемії порівняно з комбінованою терапією глімепіридом та метформіном 12, 13. Крім того, у пацієнтів з діабетом 2 типу з адекватним глікемічним контролем при монотерапії метформіном додавання ліраглутиду покращило кілька маркерів серцево-судинного ризику, припускаючи, що метформін та ліраглутид можуть мати додатковий або навіть синергетичний вплив на судинну систему 14. Однак чи має ця комбінована терапія синергетичний вплив на функції ендотелію, досі незрозуміло через відсутність відповідних експериментальних доказів. Тому в цьому дослідженні ми зосередилися на вивченні ефектів комбінованої терапії метформіном та ліраглутидом на індуковану ліпотоксичністю ендотеліальну дисфункцію та на вивченні основного механізму.

результат

Комбінована терапія з метформіном та ліраглутидом є більш ефективною, ніж одноразова терапія, для захисту від ендотеліальної дисфункції, спричиненої пальмітиновою кислотою (ПА).

У культивованих ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC) ПА індукує дисфункцію ендотелію, яка характеризується збільшенням продукування активних форм кисню (АФК), зниженням рівня NO та зниженням рівня внутрішньоклітинної фосфорильованої ендотеліальної NO-синтази (p-eNOS) у спосіб, що залежить від концентрації. методом (рис. 1а). Індукована ПА ендотеліальна дисфункція (0,5 ммоль/л) ослаблена одноразовим лікуванням вищою дозою метформіну (0,5 та 1,0 ммоль/л) або ліраглутиду (30 та 100 нмоль/л). Однак при меншій дозі метформіну (0,1 ммоль/л) або ліраглутиду (3 та 10 нмоль/л) такий захисний ефект не спостерігався (рис. 1б, в). Примітно, що комбіноване лікування з меншою дозою метформіну (0,1 ммоль/л) та ліраглутиду (3 нмоль/л) мало значний захисний ефект на підвищену регуляцію вироблення АФК, спричинену ПА, та зниження рівня білка NO та p-eNOS (Рис. 1). 1d, додаткова фігура 1), що вказує на те, що комбінована терапія була більш ефективною, ніж одноразове лікування для захисту від ПА-індукованої ендотеліальної дисфункції.

( a ) Залежний від дози вплив ПА на функцію ендотелію у HUVEC, включаючи внутрішньоклітинну продукцію АФК (верхня панель), НІ рівні супернатанту (середня панель) та рівні білка p-eNOS (нижня панель). HUVEC попередньо обробляли різними концентраціями метформіну ( b ) і ліраглутид ( c ) окремо або в поєднанні з обома ( d ) протягом 2 годин, а потім піддають дії ПА ще 22 години. Дані представлені як середні значення ± SD. n = 4. * P # P -/- миші

a ) Порушення рівня фосфорилювання GLP-1R та PKA у HUVEC, оброблених PA. ( b ) Дозозалежний вплив метформіну на рівні GLP-1R та фосфорилювання РКА у HUVEC із порушенням ПА. Рівні білка GLP-1R або p-PKA нормалізувались до GAPDH або загальних білків PKA. Дані представлені як середні значення ± SD. n = 4. * P # P

Клітини інкубували з антагоністом GLP-1R екзендіном (9-39) ( a ) або інгібітор РКА H89 ( b ) протягом 30 хвилин, а потім обробляли метформіном та ліраглутидом протягом 2 годин, а потім піддавали дії ПА ще 21,5 години. Вивчали функцію ендотелію, включаючи продукцію АФК (верхня панель), рівень NO (середня панель) та рівень білка p-eNOS (нижня панель). Дані представлені як середні значення ± SD. n = 4. * P # P † P

HUVEC попередньо обробляли активатором AICAR AMPK протягом 2,5 годин або інгібітором AMPK C протягом 30 хвилин, а потім обробляли лише метформіном (1,0 ммоль/л) ( a, b ) або комбінації метформіну (0,1 ммоль/л) та ліраглутиду (3 нмоль/л) ( c, d ) протягом 2 годин з наступним впливом ПА ще 21,5 години. Рівні білка GLP-1R ( a, c ) або p-PKA ( b, d ) нормалізувались до білків GAPDH або загальної PKA. Дані представлені як середні значення ± SD. n = 4. * P # P † P 10. Причинно-наслідковий зв’язок між вільними жирними кислотами та дисфункцією ендотелію був продемонстрований кількома способами 16, 17, 18, 19. ПА - одна з жирних кислот, яка найчастіше зустрічається у західній дієті. У нашому дослідженні in vitro РА значно погіршувала функцію ендотелію, що свідчить про збільшення внутрішньоклітинної продукції АФК та ​​зниження рівня NO та фосфорилювання eNOS. Подібним чином наше дослідження in vivo продемонструвало, що вазодилатаційна залежність вазодилатаційної залежності вазодилатації у мишей ApoE -/-, які годували HFD.

AMPK і PKA є двома ключовими регуляторами клітинного метаболізму. Взаємодія між AMPK та PKA була добре задокументована в декількох дослідженнях 40, 41, 42. Активація AMPK збільшує активність РКА, тоді як РКА самостійно або пригнічує активність білка фосфатази-2С, специфічну для Ser/Thr, тим самим побічно модулюючи активність AMPK у первинних судинних клітинах гладкої мускулатури щурів 41. У цьому дослідженні ми виявили, що активація AMPK послаблює PA-індуковане зниження фосфорилювання PKA в HUVEC. Наші висновки можуть пролити нове світло на сигнальну мережу в ендотеліальних клітинах. Крім того, інгібування РКА послаблює вплив метформіну на ПА-індуковану дисфункцію ендотелію, припускаючи, що РКА може брати участь у захисному впливі метформіну на ендотеліальні клітини. Тим не менш, необхідні подальші дослідження для визначення перехресних зв’язків між шляхами AMPK та PKA для поліпшення функції ендотелію.

Таким чином, комбінована терапія з метформіном та ліраглутидом, аналогом GLP-1, має синергетичний ефект проти ПА-індукованої дисфункції ендотелію. Функція метформіну у підвищенні рівня GLP-1R та фосфорилювання PKA в ендотеліальних клітинах може сприяти синергетичному захисному ефекту цієї комбінованої терапії, що дає нові уявлення про взаємодію між метформіном та агентами GLP-1 (рис. 7). Можливо, метформін може посилити або посилити судинну захисну дію GLP-1 та його аналогів. Отримані нами результати дають важливу інформацію для розробки нових терапевтичних стратегій на основі GLP-1 при лікуванні діабету 2 типу.

Індукована пальмітиновою кислотою (ПА) ендотеліальна дисфункція характеризується підвищеною продукцією АФК, зниженням рівня NO та зниженням фосфорилювання eNOS. Лікування лише метформіном або ліраглутидом може запобігти дисфункції ендотеліальних клітин ПА. Комбінована терапія з метформіном та ліраглутидом має синергетичну дію на ПА-індуковану дисфункцію ендотелію. Крім того, метформін регулює GLP-1R та його передачу сигналу РКА, що може бути відповідальним за його синергетичну захисну дію з ліраглютидом у ендотеліальних клітинах із порушеннями РА. Метформін також може активувати сигналізацію PKA незалежно від GLP-1R. Вищевказані ефекти метформіну опосередковуються шляхом AMPK. Червоні стрілки вказують на наші нові результати цього дослідження.

Повнорозмірне зображення

Матеріали і методи

реагенти

Ліраглутид постачав Novo Nordisk (Багсверд, Данія). PA, сполука C інгібітора AMPK та антагоніст GLP-1R екзендін (9-39) були придбані у Sigma (Сент-Луїс, Міссурі, США). Активатор AMPK AICAR був виготовлений компанією Beyotime Biotechnology (Шанхай, Китай). Інгібітор РКА H89 був наданий Cell Signaling Technology (Беверлі, штат Массачусетс, США). Мишачі анти-eNOS та анти-фосфо-Ser-1177-eNOS (p-eNOS) антитіла були від BD Biosciences (Сан-Джо, Каліфорнія, США). Мишаче моноклональне антитіло проти GLP-1R було від DSHB (штат Айова, штат Іллінойс, США). Кроличі анти-PKAα, анти-фосфо-Thr197-PKA C (p-PKA), анти-AMPKα та анти-фосфо-Thr-172-AMPKα (p-AMPK) були отримані з технології Cell Signaling Technology. Мишаче антитіло проти GAPDH від Zhongshan Biotechnology (Пекін, Китай).

Дослідження in vitro

Підготовка ПА

ПА 256 мг розчиняють у 5 мл абсолютного етанолу, а потім титрують 0,1 мл/л гідроксиду натрію 5 мл при 70 ° C. Нарешті, суміш 10 мл ПА з 190 мл 10% БСА при 55 ° С додавали для утворення комплексу при концентрації 5 ммоль/л. Вихідний розчин стерилізували фільтруванням і зберігали при -20 ° C. Аналогічним чином готували контрольний розчин, що містив 5% етанолу та 9,5% BSA.

Культура клітин та лікування

HUVEC були зібрані у здорових донорів за письмовою інформованою згодою. Протокол цього дослідження був схвалений Комітетом з етики третьої лікарні в Пекіні. Всі проведені процедури відповідали відповідним рекомендаціям та правилам. HUVEC готували та культивували, як описано раніше 43. Всі експерименти проводили з використанням клітин у пасажі 6. Для інкубації протягом 24 годин використовували серію концентрацій ПА (0, 125, 0, 25 та 0,5 ммоль/л) для індукції ендотеліальної дисфункції. У більшості нашого дослідження в якості пошкодженої моделі використовували вплив HUVEC 0,5 ммоль/л PA. Попередня обробка HUVEC метформіном (0, 1, 0, 5 та 1,0 ммоль/л) або ліраглутидом (3, 10, 30 та 100 нмоль/л) проводилася за 2 години до впливу ПА та протягом 22 годин. У комбінованому експерименті клітини обробляли метформіном (0,1 ммоль/л) та ліраглутидом (3 нмоль/л). Для з'ясування задіяних сигнальних шляхів клітини інкубували з AICAR (0,5 ммоль/л), сполукою С (10 мкмоль/л), екзендіном (9-39) (200 нмоль/л) або H89 (10 мкмоль/л). протягом 30 хвилин. хв. перед іншими процедурами.

HUV-EC-C, клітинна лінія HUVEC, була використана в експерименті нокдауну. Ця клітинна лінія походить від Центру клітинних ресурсів при Шанхайському науково-дослідному інституті життєдіяльності (Китай) і культивується в DMEM (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) з додаванням 10% FBS.

Втручання РНК

Щоб приглушити експресію генів GLP-1R та PKA, клітини трансфікували siРНК з використанням ліпофектаміну RNAi MAX (Invitrogen). Три форми siRNA були включені для кожного нокдауну конкретного гена, а неспоріднена скрембована siRNA була використана як контроль без будь-якої ідентичності в геномній послідовності людини. Після трансфекції протягом 48 годин клітини обробляли метформіном (1,0 ммоль/л) протягом 2 годин з подальшим експозицією ПА ще 22 години.

Виявлення внутрішньоклітинних АФК

АФК вимірювали за допомогою флуоресцентного зонда 2 ', 7'-дихлорфлуоресцину діацетату (DCFH-DA, Sigma), який можна гідролізувати до DCFH у клітинах. Коли нефлуоресцентний DCFH окислюється АФК, він перетворюється на високофлуоресцентний DCF. Коротко кажучи, в кінці лікування клітини інкубували з DCFH-DA (20 мкмоль/л) протягом 30 хвилин при 37 ° С, а потім двічі промивали. Інтенсивність флуоресценції DCF перевіряли за допомогою проточного цитометра (BD Biosciences). Елементи контролю встановлювались на рівні 100% АФК.

Виявлення НІ супернатанту

NO визначали методом нітритредуктази з використанням набору від Beijing 4A Biotech Co., Ltd (Китай). В кінці лікування з кожної групи збирали супернатанти культури клітин. Для встановлення аналізу готували пробірки з 0,1 мл дистильованої води, стандартним розчином та зразками для обробки, а потім додавали PBS та нітрат-редуктазу до кожної пробірки. Після інкубації протягом 1 години при 37 ° С додавали два робочі розчини для ко-інкубації ще протягом 10 хвилин. Поглинання при 450 нм у кожній пробірці вимірювали за допомогою зчитувача мікропланшетів. Рівень NO у кожній групі нормалізувався до загального білка.

Вестерн-блот

Білки відокремлювали 10% (мас./Об.) SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрани випробовували з первинними антитілами (усі при розведенні 1: 1000) протягом ночі при 4 ° С, а потім інкубували з кон’югованим IRDye 800CW козячим анти-кролячим IgG або козячим анти-мишачим IgG (обидва при розведенні 1: 10000); LI-COR Biosciences, Лінкольн, Небраска, США) протягом 1 години. Білкові смужки візуалізувались за допомогою інфрачервоної системи зображення Odyssey (LI-COR Biosciences).

Дослідження in vivo

Експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин при Пекінському університеті і проводились відповідно до національних та міжнародних рекомендацій. Восьмитижневих самців мишей дикого типу та ApoE -/- (тваринний центр Vital River, Пекін, Китай) поселяли у специфічних умовах, вільних від патогенів, з 12-годинним циклом світло-темрява. Експерименти проводились через тиждень акліматизації. Мишей дикого типу годували нормальним харчуванням, тоді як мишей ApoE -/- годували HFD, що містив 0,15% холестерину і 41% жиру (MD12015, Medicine Ltd, Янчжоу, Цзянсу, Китай) протягом 8 тижнів. Протягом останніх чотирьох тижнів мишей ApoE -/- було розділено на чотири групи (по 6 мишей на групу), включаючи контрольних (PBS, ip, двічі на день), метформіну (100 мг/кг на добу, питна вода та PBS) ip, двічі на день), ліраглутид (30 мкг/кг на день, внутрішньовенно, два рази на день) та комбінація (метформін, 100 мг/кг на день, з питною водою; і ліраглутид, 30 мкг/кг на день, внутрішньовенно, два рази) щодня ). Вагу тіла вимірювали перед лікуванням, а потім щотижня до жертви.

Підготовка аортальних кілець та вимірювання розширення судин

Після лапаротомії середньої лінії під наркозом пентобарбіталу натрію аорту швидко вирізали для вимірювання судинної реактивності, як описано вище 44. Після стабілізації в буфері Кребса протягом 30 хвилин кільця аорти деполяризували хлоридом калію (60 ммоль/л) для оцінки їх максимального скорочення. Після двох промивань аортальні кільця віднімали шляхом стимуляції фенілефрином (10-6 моль/л). Коли стабілізувалась скорочувальна реакція (стаціонарна фаза, 15 хв), досліджували вазорелаксуючі реакції на підвищену концентрацію Ach. Напруга спокою аортальних кілець була відрегульована до 1,0 г. Зміни судинної напруги було виявлено за допомогою самопишучого пристрою (ADInstruments, Белла Віста, Австралія).

ВІН та імунохімічне фарбування

Тканини аорти, включаючи корінці аорти та висхідну аорту, були зібрані для підготовки зрізів товщиною 7 мкм. Зрізи тканин спочатку були ідентифіковані за допомогою фарбування ВІН. Для імунохімічного фарбування зрізи обробляли 3% перекисом водню протягом 10 хв, щоб блокувати активність ендогенної пероксидази, та інкубували в буферній звичайній конячій сироватці, щоб запобігти неспецифічному зв’язуванню антитіл. Потім зрізи інкубували з антитілом проти p-eNOS (1:50; Sigma) або GLP-1R (1:10) протягом ночі при 4 ° C і піддавали імуногістохімічному аналізу.

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SD. Різницю між групами аналізували за допомогою одностороннього аналізу ANOVA з подальшим тестом Тукі-Крамера. Значення P