реферат

Призначення: Окисне фосфорилювання знаходиться під подвійним генетичним контролем ядерної та мітохондріальної ДНК (mtDNA). Порушення окисного фосфорилювання є клінічно та генетично неоднорідними, що ускладнює виявлення генетичного дефекту, а протоколи, засновані на симптомах, пов’язують клінічні симптоми безпосередньо з певним геном мтДНК або мутацією відстають. Крім того, підраховано, що приблизно 25% педіатричних пацієнтів із порушеннями окисного фосфорилювання мають мутації мтДНК, і стандартний підхід до скринінгу загальних мутацій та делецій пояснює лише деякі з цих випадків. Тому ми протестували новий метод скринінгу mtDNA на основі CHIP.

Методи: Повторне секвенування MitoChip (Affymetrix) проводили на трьох тестових зразках та на 28 зразках пацієнтів.

Результати: Частота дзвінків становила в середньому 94%, а рівні виявлення гетероплазми коливалися в межах 5-50%. Генетичний діагноз може бути поставлений майже у чверті пацієнтів з потенційним виходом 8 повних послідовностей mtDNA кожні 4 дні. Крім того, було виявлено ряд потенційно патогенних некласифікованих варіантів (УФ).

Висновки: Наявність протоколів ПЛР на великих діапазонах та переважання однозамісних замін у мтДНК роблять послідовності CHIP дуже швидким та надійним методом скринінгу повної мтДНК на мутації.

Головний

Порушення окислювального фосфорилювання (OXPHOS) вражають принаймні 1 з 8000 всього населення і належать до групи найпоширеніших спадкових метаболічних захворювань. Прояви хвороби, спричинені дефектами OXPHOS, можуть бути дуже різними, але зазвичай включають тканини з високим енергоспоживанням, такі як серце, м'язи, нирки та ендокринна система. Відомо кілька добре описаних синдромів, таких як Кернс-Сейр (KSS) та синдром Пірсона, невропатія атаксія пігментного ретиніту (NARP), мітохондріальна енцефаломіопатія, лактатний ацидоз та інсультоподібні епізоди (MELAS) та міоклональна епілепсія (MER червоний) та o. ). Однак дефекти OXPHOS можуть також проявлятися більш поширеними та менш специфічними симптомами, такими як діабет 2 типу, глухота, енцефалопатія, міопатія та кардіоміопатія. Отже, розлади OXPHOS спричиняють значну захворюваність та смертність та мають великий вплив на здоров’я населення.

Приблизно 25% педіатричних пацієнтів із порушеннями OXPHOS мають мутації мтДНК, але їх важко знайти через генетичну та клінічну неоднорідність. 3 Оскільки кількість мутацій mtDNA зросла до більш ніж 250, а клінічна специфічність відстає, протоколів, що базуються на симптомах, недостатньо, і переважним є скринінг цільної mtDNA. 4 Нещодавно представлений MitoChip (Affymetrix) - це новий метод резекції мтДНК. 5, 6 У цій роботі ми описуємо наш досвід повного скринінгу mtDNA у 28 пацієнтів з OXPHOS із використанням послідовності MitoChip.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Зразки пацієнта та тесту

Геномну ДНК виділяли з м’язів згідно з протоколом Mullenbach et al. ДНК від 3 пацієнтів із традиційною послідовністю, пацієнта з гетероплазматичною делецією 5 bp, 8 та 28 пацієнтів з клінічним та/або біохімічним фенотипом захворювання OXPHOS аналізували на MitoChip. Всі ці пацієнти були негативними щодо мутацій MELAS m.3243A> G, MERRF m.8344A> G та NARP m.8993T> C/G та великих делецій mtDNA.

MitoChip та експериментальна процедура

Аналіз даних

Програмне забезпечення Affymetrix GeneChip DNA Analysis Software (GDAS) версії 3.0.1.3 бета було використано для аналізу файлів .CEL із використанням налаштувань програми за замовчуванням. Файл звіту був створений GDAS зі списком варіантів нуклеотидів для обох фрагментів мікросхеми порівняно з Переглянутою Кембриджською довідковою послідовністю (RCRS). 4, 11 Різницю між нуклеотидними проблемами для обох фрагментів чіпів оцінювали вручну. Останні великі зміни були записані у текстовий файл ("вихідний вихідний файл"). Другий аналіз був проведений за допомогою R, вільного програмного середовища для статистичних розрахунків та графіки. 12 При аналізі R кожен чіп (файл .CEL) аналізували окремо. Нуклеотид з найбільшою інтенсивністю сигналу визначали для кожного положення, ігноруючи фоновий сигнал. Нуклеотидні зміни були надруковані у текстовому файлі ("R вихідний файл"). Нарешті, "вихідні вихідні файли" та "вихідні файли R" були зіставлені та об'єднані, що дало список варіантів для кожного зразка. Невідповідність між виходами GDAS і R оцінювались вручну безпосередньо, переглядаючи зображення мікросхеми або звичайним секвенуванням. Якщо не зазначено інше, у цьому документі термін "аналіз MitoChip" відноситься до комбінованого аналізу GDAS та R.

Перевірка гетероплазматичних варіацій та рівнів

Обидві нитки фрагмента, що несе варіант, циклічно секвенсувались за допомогою комплекту секвенування циклу BigDye Terminator v3.1, генетичного аналізатора ABI-PRISM 3100 та програмного пакету Sequence Analysis 3.7. Рівень гетероплазми визначали шляхом мутації специфічного рестрикційного травлення. У випадку, якщо сайт рестрикції був отриманий або втрачений, фрагменти ампліфікували за допомогою праймерів, що оточують основну варіацію, інакше спеціальний праймер невідповідності був розроблений для створення сайту рестрикції. Для ампліфікації ПЛР до реакції в останньому циклі ПЛР додавали мічений праймер для маркування продуктів ПЛР. Помічені продукти ПЛР перетравлювали, а фрагменти аналізували на генетичному аналізаторі ABI-PRISM 3100 за допомогою програмного пакету GeneScan Analysis 3.7 (Applied Biosystems). Рівень гетероплазми визначали шляхом обчислення співвідношення площі піку мутанта або дикого типу (залежно від посилення або втрати сайту рестрикції внаслідок варіації нуклеотидів) та суми площ піків мутанта та дикого типу. Первинні послідовності та умови реакції доступні за запитом.

РЕЗУЛЬТАТИ

Виконання та перевірка MitoChip

варіація mtDNA у 28 пацієнтів

Всього було виявлено 520 варіацій у 28 пацієнтів, з них 197 - унікальні нуклеотидні заміни. Загалом у 11 пацієнтів було виявлено 15 гетероплазматичних варіацій. Чотири з цих варіацій були підтверджені секвенуванням та специфічним для мутацій розщепленням (m.15939C> T при 7%, m.13513G> A при 14%, m.3243A> T при 34% і m.13042G> A при 84% ); було показано, що дві гомоплазматичні вставки однієї пари основ (m.3229_3230insA та m.3158_3159insT); два виявились хибнопозитивними; один виявився гомоплазматичним поліморфізмом (m.15452C> A); решта шість не проходили тестування, оскільки їх не вважали патогенними. З усіх виявлених варіацій були відомі три патогенні мутації (таблиця 1), 114 були опубліковані як поліморфізми (додаткова таблиця 1), 41 не призвів до змін амінокислот і, швидше за все, були поліморфізмами (додаткова таблиця 1), а 39 були некласифікованими (УФ)., Деякі з яких, ймовірно, були патогенними (табл. 2). Вісім варіантів були локалізовані в молекулах тРНК (рис. 1). У трьох пацієнтів були виявлені відомі патогенні мутації, а у 23 - УФ. У п’яти пацієнтів були виявлені лише поліморфізми.

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

мутацій

Вісім мутацій тРНК (некласифіковані варіанти та мутації) були виявлені у 28 пацієнтів з OXPHOS. Варіація m.3243A> T у тРНК-Leu1, m.4336T> C варіація в гені tRNA-Gln, m.5558A> Варіація G у гені tRNA-Trp, m.5592A> Варіація G у тРНК-Ala ген, m .5850T> варіація C у гені tRNA-Tyr, m.12308A> варіація G у гені tRNA-Leu2 та m.15890C> варіація T та m.15939C> варіація T у гені tRNA-Thr. Зображення адаптовані з веб-сайту, що займається компіляцією генів тРНК ссавців (//mamit-trna.u-strasbg.fr/index.html). 32

Повнорозмірне зображення

УФ оцінювали на еволюційний захист, на функціональну значимість, визначаючи вплив на тРНК або білок і, якщо є, на сегрегацію в сім’ї. Сім УФ були розміщені в шести генах тРНК (рис. 1), 11 УФ в генах 12S і 16S рРНК, один УФ на місці термінатора транскрипції мтДНК і 20 УФ в генах, що кодують білки. З восьми варіантів тРНК (рис. 1) варіація m.15939C> T у гені тРНК-Thr була гетероплазматичною з мутаційним навантаженням 7%. Всі інші варіанти тРНК були гомоплазматичними або близькими до гомоплазматичних (мутація навантаження> 98%). Дві з варіацій генів, що кодують білок, були гетероплазматичними 84% та 70% для m.13042G> A у гені ND5 та m.14258G> A у гені ND6.

Були виявлені також одиничні вставки нуклеотидів. Перехід гетероплазматичного m.3158A> T до CHIP показав, що стандартним секвенуванням є вставка одного нуклеотиду (m.3158_3159insT). Крім того, гомоплазматична вставка m.3229_3230insA була спочатку виявлена ​​за допомогою аналізу MitoChip як гетероплазматичний перехід m.3229T> A.

ОБГОВОРЕННЯ

Виконання та перевірка MitoChip

MitoChip порівняно з іншими методами

Стіл в натуральну величину

Варіації МтДНК у 28 клінічних зразках

Повторення не тільки виявляє відомі патогенні мутації або поліморфізми, але також ультрафіолетові промені та фактори ризику не пов’язаної патології, такі як рак, хвороба Альцгеймера або хвороба Паркінсона. Оскільки значення цієї другої групи варіацій для окремих випадків та їх сімей досі незрозуміле, а фактори ризику не можуть пояснити первинну патологію, очевидно, що ці дані повинні ретельно розглядатися клініцистами. Пацієнтів слід проінструктувати про невизначеність деяких спостережень та труднощі в інтерпретації деяких результатів. Однак це необхідно і не зважує генетичні діагнози. Це також буде тимчасовою проблемою, оскільки буде отримано більше інформації про нейтральні поліморфізми, реальні фактори ризику захворювання та реальні патогенні мутації в результаті спільних зусиль щодо секвенування.

ВИСНОВОК

Повторна послідовність MitoChip - це швидкий, економічний та надійний метод з високопродуктивними можливостями для повного скринінгу mtDNA. Чверть пацієнтів з OXPHOS може бути генетично діагностована за допомогою цієї методики шляхом виявлення трьох патогенних та трьох або чотирьох ймовірних патогенних мутацій у 28 пацієнтів, що підтверджує вищезазначений відсоток. 3 Через збільшення кількості мутацій mtDNA у поєднанні зі зростаючою клінічною неоднорідністю, повторне секвенування MitoChip є найкращим методом скринінгу mtDNA на мутації, особливо коли специфічний для симптомів скринінг та скринінг лише найпоширеніших мутацій mtDNA не досягає.

Дякую

Це дослідження було підтримано Фондом Принцеси Беатрікс (номер гранту: MAR99-0111) та проектом MitoCircle (грант ЄС, Шоста рамкова програма, контракт № 005260).