Джерело: Рада з наукового, гуманістичного та технологічного розвитку Університету Центрально-Східної Європи "Лісандро Альварадо" (UCLA, Венесуела)

стан

Бенефіціар: Аура Аміріка Лупес-Ортега, Ізабель Крістіна Мркес-Альварадо, Алейді Йозефіна Арангурен-Парра, Мігель Бнгел Плаза-Карріун та Марна Дівіна Мурільо Лупес де Сіланес

Ключові слова: жирова печінка, етіонін, окислювальний стрес, дисфункція.

Анотація: У ветеринарній медицині роль окисного стресу (ОС) у тваринництві та розмноженні набула важливого значення через зміну обох функцій у тварин із гепатостеатозом або жировою печінкою (ФЛ). Це дослідження мало на меті визначити, чи було встановлено стан печінкової ОС в експериментальному ФЛ, спричиненому етіоніном, у дорослих мишей-самців ЯМР та чи була змінена функція печінки. Використовували дві групи з 10 тварин: одну контрольну та іншу, оброблену DL-етіоніном внутрішньочеревно при 7,5 мг/20 г маси тіла. Величину та характеристики FL визначали гістологічно, а кількість депо жиру печінки встановлювали за концентрацією тригліцеридів. Обидва аналізи підтвердили генерацію гепатостеатозу у чоловіків, яким вводили DL-етіонін. Продукти ліпопероксидаційної деградації (кон'юговані дієни (CD) та малоновий діальдегід (MDA), показники клітинної ОС, кількісно визначали спектрофотометрично за його концентрацією в гомогенаті печінки. Пошкодження функції печінки вимірювали за плазматичним рівнем аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази ( AST), використовуючи комерційні набори.Індукція FL викликала значне підвищення CD з 231,18 ± 15,53 мкмоль/мг білка до 297,45 ± 23,10 ммоль/мг білка (P

Ключові слова: Жирова печінка, етіонін, окислювальний стрес, дисфункція.

Окислювальний стрес (ОЕ) бере участь у запальних процесах, а також захворюваннях печінки, повідомляється про високі концентрації активних видів О2 (АФК) [18], а походження ураження печінки пов’язане з існуванням вільних радикалів (РЛ), які може ліпопероксидувати клітинні компоненти, такі як мембрани, і викликати зміни, що призводять до втрати клітинної функції. При НАЖХП функція печінки впливає, як було експериментально визначено [13]. Дане дослідження мало на меті визначити, чи в експериментальному ГГ, спричиненому етіоніном у лабораторних мишей-альбіносів (Mus musculus Linnaeus, 1758), ЯМР дорослих чоловіків було встановлено статус ЕО в печінці, а також кількісно оцінити можливі зміни функції сказав орган.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Для цього дослідження були використані миші-самці з популяції лабораторних мишей-альбіносів, зокрема штаму NMRI, з Центрального тваринницького фонду Університету Центроцидент Лісандро Альварадо (UCLA), Венесуела. Шляхом простого випадкового відбору зразків було відібрано 20 дорослих мишей-самців із середньою масою тіла 27,5 ± 1,5 г (г) за шкалою Огауса (Tripe Bean Balance, серія 700, Флорем-Парк, Нью-Джерсі, США), поміщені в окрему нержавіючу сталь клітини, при світлових циклах 12 годин (год) світла/12 год темряви в стандартизованих умовах Біотерію Науково-дослідного підрозділу з функціональних наук "Доктор Хайти Мусатче" (UNIHM) Декан наук, Ветеринарна медицина UCLA (DCV). З вільним доступом до води та комерційних кормів для мишей Ratarina® (Protinal, Венесуела). Дослідження проводилось відповідно до Кодексу біоетики та біобезпеки FONACIT-Венесуела [10].

Індукція безалкогольного HG:

Тварин розподіляли випадковим чином у двох групах по 10 тварин у кожній: контрольній і іншій, якій вводили DL-етіонін (Sigma Chemical Co., MO, США), розчинений у стерильному фізіологічному розчині, вводили внутрішньовенно. у дозах 7,5 мг/20 г маси тіла. Елементи контролю вводили лише засіб (стерильний фізіологічний розчин). Обидві групи пройшли 48-годинний піст з безкоштовним доступом до питної води.

Відбір проб, визначення:

Після голодування протягом 48 год у мишей шляхом копчикової венепункції отримували зразок крові, оброблений етилендіамінтетраоцтовою кислотою (EDTA) -Na 2% антикоагулянт. Плазму відокремлювали центрифугуванням (800 г, 20 4 хв.) В охолодженій мікроцентрифузі Eppendorf 5402 (Brinkman Instr., NY, США) та зберігали в холодильнику Mabe RMT, 41XMVEB (Колумбія). Після отримання зразка крові тварин піддавали евтаназії під легким наркозом ефіром. Печінку розсікали, оцінювали її макроскопічний вигляд і поміщали в 250 мМ трис-сахарозний буфер рН 7,2 при 4 єС. 1,5 г печінки гомогенізували у 3-кратному вазі у трис-сахарозному буфері при 4 ° С у гончарі з бодіном NSI-12 (Electric Comp., Чикаго, США). Супернатант гомогенату, розведений 1:40 деіонізованою водою, витримували в холодильнику до нанесення відповідних аналізів.

Визначення величини та характеристик HG: Невелика частина печінки, фіксована у 10% забуференному формаліні, була використана для її гістогістологічного дослідження, проведеного в лабораторії патологоанатомічного відділення ветеринарної лікарні “Dr. Humberto Ramnrez Daza »від DCV-UCLA. 4 мікронні зрізи тканини отримували за допомогою мікротома Jung AG (Гейдельберг, Німеччина) та подальшого фарбування зрізів гематоксилін-еозином згідно із загальноприйнятою методикою.

Кількість відкладень жиру в печінці: У розведеному супернатанті гомогенату печінки концентрацію тригліцеридів визначали ферментативним методом із використанням набору Qualitest (Ind. Qualitest, Каракас, Венесуела). Результати виражали в міліграмах (мг) тригліцеридів/мг білків, які визначали за допомогою набору Пірса (ILL, США) на основі техніки Бредфорда [5].

Кількісна оцінка продуктів розпаду ліпопероксидації: У супернатанті печінкового гомогенату визначали концентрацію кон'югованих дієнів (DC) за допомогою методики, описаної Wallin [22], а також концентрацію малонового діальдегіду (MDA) за допомогою TBARS (реагенти з 2-тіокислотою барбітурату) за Охкавою [21].

Визначення пошкодження функції печінки: У плазмі крові активність аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST) визначали за допомогою комерційних наборів (Wiener lab, Rosario, Argentina). Всі спектрофотометричні показники проводили на Genesys 5 (Нью-Йорк, США).

Статистичний аналіз результатів: Проведено за допомогою статистичного програмного забезпечення SPSS (Статистичний пакет для соціальних наук або Статистичні рішення для продуктів та послуг) версії 17.0 для Windows. Результати були виражені як середнє значення значень ± стандартна похибка. Для встановлення статистичної значущості результатів використовували критерій Стьюдента, який вимагав 95% достовірності (Р РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

На фіг. Фіг.1A показує макроскопічний вигляд контрольної дорослої печінки мишей чоловічої миші ЯМР з темним відтінком, а на фіг.1B - печінку тварини, якій вводили DL-етіонін, який має світлий колір на відміну від контрольної тварини. Гістологічне дослідження печінки на контрольних дорослих мишах-ЯМР-самцях показало клітини печінки з нормальним зовнішнім виглядом (ФІГ. 1С). Однак у печінці мишей, які отримували DL-етіонін, спостерігався помірний метаморфоз печінкового жиру з великими та малими цитоплазматичними вакуолями в гепатоцитах та наявністю мегалоцитів та клітинних клітин (рис. 1D).

Окислювальний стрес: кількісне визначення за допомогою DC та MDA

Окислювальний стрес визначали кількісно за рівнем кон'югованих дієнів у печінці (DC) та малонового діальдегіду (MDA). Було відмічено, що постійний струм був значно підвищеним (Р, КОНЦЕНТРАЦІЯ ПЕЧІНІ: (2А) постійного струму та (2В МДА У КОМПЛЕКСІВ ДОСЛІДНИХ ЧАСТИН ЯМР ЯК) І З ІНГУЛИРОВАНОЮ ДЛ-ЕТІОНІНОМ HG (7,5 МГ/20 Г ТЕЛА). S З 10 ТВАРИН/ГРУПА; * P

Печінкове відкладення: кількісне визначення тригліцеридів

Печінка самців мишей, яким вводили DL-етіонін, продемонструвала значне підвищення (P HEPBTIC TG КОНЦЕНТРАЦІЯ У САМОГО ЯМР-КОНТРОЛЮ ДОСЛІДНИХ І ІНГУЛИРОВАНИХ HG ДЛ-ЕТІОНІН МИШІВ (7,5 МГ/20 Г ТЕЛА) 10 ТВАРИН/ГРУПА; ** С

Пошкодження функції печінки: кількісне визначення ALT та AST

Введення DL-етіоніну дорослим самцям мишам ЯМР було значно збільшено (Р ПЛАЗМБТИЧНА АКТИВНІСТЬ АЛТ І АСТАНАЛЬНИХ ТРАНСАМІНАЗ У КОНТРОЛОВАНИХ ДОСЛІДНИХ МИШЕЙ З ІНДУКОВАНИМ DL-ЕТІОНІНОМ HG (7,5 МГ/20 Г ТЕЛА). 10 ТВАРИН/ГРУПА; ** С

HG може бути одним з основних метаболічних змін перипартуального бичачого м’яса [23]. Введення холіну свіжим коровам запобігає ГГ [17].

Експериментальні моделі для дослідження НАЖХП на лабораторних тваринах [20] дали не лише важливий внесок з точки зору вже зазначених аспектів, але і стосовно використання терапевтичних засобів, особливо натуральних продуктів. У цьому дослідженні дорослих самців мишей ЯМР використовували як експериментальну модель, в якій НАЖХП індукували i.p. (7,5 мг/20 г маси тіла) DL-етіоніну, етилового аналога метіоніну (Met), який витісняє амінокислоту з її нормальних метаболічних шляхів, індукуючи зменшення печінкового АТФ синтезу білка і, як наслідок, зменшення серед інші - з ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПНЩ), які експортують ліпіди з печінки в кров. Слід зазначити, що Met трансформується в печінці тварин під дією ферменту Met-аденозилтрансферази, який каталізує його перетворення в S-аденозил-Met [14].

Гістопатологічне дослідження печінки самців мишей, яким вводили DL-етіонін, призвело до помірного метаморфозу печінкового жиру з гепатоцитами, цитоплазми яких мали великі та малі вакуолі, крім присутності мегалоцитів та клітинних клітин. Ці результати узгоджуються з результатами, отриманими у самців щурів Sprague Dawley, яких протягом п’яти тижнів годували збагаченою фруктозою дієтою, яка показала гістопатологічні зміни в печінці, що характеризуються легкими та помірними макро- та мікровезикулярними жировими відкладеннями з мінімальними ознаками перисинусоїдального фіброзу. ]. З іншого боку, додавання в раціон 0,5% ніацину, терапевтичного засобу при лікуванні дисліпідемії та серцево-судинних захворювань, зменшує гепатостеатоз, спричинений дієтою з високим вмістом жиру, даної самцям щурів Sprague Dawley, що характеризуються вираженим мікро- та макростеатозом. внутрішньопечінкові вакуолі діаметром від 4 до 10 мм [11].

Безалкогольна жирова хвороба печінки є, мабуть, найпоширенішою причиною підвищення рівня амінотрансфераз у сироватці крові в західному світі, а також в азіатському світі [4]. Гостре або хронічне ураження печінки незмінно пов'язане з підвищенням рівня трансаміназ плазми крові аланінамінотрансферази (АЛТ), ферменту з внутрішньоклітинним розташуванням, головним чином цитоплазматичним, та аспартатамінотрансферази (АСТ), розташованого в двох внутрішньоклітинних та мітохондріальних областях клітини та мітохондріях. Найвища концентрація в печінці та її підвищення розглядається як специфічне для пошкодження печінки [12].

У цьому дослідженні було відмічено, як у мишей-самців NMRI, яким вводили DL-етіонін, виявлено, що активність ALT та AST у плазмі крові значно підвищена порівняно з відповідними контролями. Ці результати збігаються з іншими повідомленнями, які показують, що CCl4, потужний гепатотоксичний агент, індукує збільшення сироваткових параметрів ураження печінки, таких як ферменти ALT та AST у самців щурів-альбіносів штаму Wistar [1]. Крім того, введення CCl4 самцям мишей Куньмін викликає гостру гепатотоксичність, про що свідчить значне підвищення рівня АЛАТ та АСТ у сироватці крові та антиоксидантів печінки [7]. Співвідношення AST/ALT може спрямовувати діагноз щодо типу гепатостеатозу, таким чином, значення більше 2 робить HG алкогольної природи вірогідним [12]. У цьому дослідженні значення мишей AST/ALT 1,4 було отримано у мишей-самців із HG, результати відповідають його неалкогольній природі.

Відповідно до результатів, отриманих у цьому дослідженні, введення мишам-самцям шляхом i.p. DL-етіонін у дозі 7,5 мг/20 г маси тіла індукує неалкогольну жирову печінку (НАЖХП), що характеризується помірним метаморфозом печінкового жиру та посиленим відкладенням тригліцеридів у печінці. Індукований етіоніном НАЖХП викликав стан печінкового окисного стресу та підвищений рівень АЛТ та АСТ у плазмі крові, що свідчить про порушення функції печінки.

Автори висловлюють подяку Раді з наукового, гуманістичного та технологічного розвитку Університету Центроцидентал "Лісандро Альварадо" (UCLA, Венесуела) за фінансування цього дослідження.

1. АБДЕЛ-МОНЕЙМ, А.М.; АЛ-КАХТАНІ, М.А .; ЕЛ-КЕРШ, М.А .; AL-OMAIR, M.A. Поглинання вільних радикалів, протизапальна/антифібротична та гепатопротекторна дії таурину та силімарину проти пошкодження печінки щурів, спричинених CCl4. PLOS ONE. 10 (12): e0144509. 2015 рік.

2. АККЕРМАН, З.; ОРОН-ГЕРМАН, М.; ГРОЗОВСЬКИЙ, М.; РОЗЕНТАЛЬ, .T; ПАППО, О.; ПОСИЛАННЯ, Г.; SELA, B.A. Індукована фруктозою жирова хвороба печінки печінкові ефекти артеріального тиску та зниження рівня тригліцеридів у плазмі крові. Гіпертонія 45 (5): 1012-1018. 2005 рік.

3. АХМАД, Д.; ГУЛЬФРАЗ, М.; АХМАД, М.С .; НАЗІР, Х .; ГУЛ, Х.; ASIF, S. Захисна дія Taraxacum officinale на CCl4, індуковану гепатотоксичністю у щурів. Афр. Дж. Фарм. Фармакол. 8 (30): 775-780. 2014 рік.

4. АЛАМ, С.; NOOR-E-ALAM, S.M.; ЧОУДХУРІ, З.Р .; АЛАМ, М.; KABIR, J. Безалкогольний стеатогепатит у пацієнтів з неалкогольною жировою хворобою печінки Бангладеш. Світ Дж. Гепатол. 5 (5): 281-287. 2013 рік.

5. БРЕДФОРД, М.А. Швидкий і чутливий метод для кількостей мікрограмів білка, використовуючи принцип зв’язування білка з барвником. Аналітик. Біохім. 72: 248-254. 1976 рік.

6. BRAUNERSREUTHER, V .; ВІВІАНІ, Г.Л.; МАХ, Ф .; МОНТЕККО, Ф. Роль цитокінів та хемокінів у неалкогольній жировій хворобі печінки. Світ J. Gastroenterol. 18 (8): 727-735. 2012 рік.

7. ЧЕН, П.; ЧЕН, Ю.; ВАНГ, Ю.; CAI, S.; ДЕНГ, Л.; LIU, J .; ZHANG, H. Порівняльна оцінка гепатопротекторної активності геніпозиду, кроцинів та кроцетину за допомогою CCl4-індукованої печінки у мишей. Biomol. Тер. (Сеул). 24 (2): 156-162. 2016 рік.

8. ДОНТАМСЕТТІ, С .; БХЕЙВ, В.С.; МІТРА, М.С .; ЛАТЕНДРЕСС, Дж. МЕХЕНДЕЛ, Х.М. Безалкогольна жирова печінка сенсибілізує щурів до гепатотоксичності чотирихлористого вуглецю. Гепатол. 45 (2): 391-403. 2007 рік.

9. ФАББРІНІ, Е .; МОХАММЕД, Б.С .; МАГКОС, Ф .; КОРЕНБЛАТ, К.М.; ПЕТЕРСОН, Б.В.; КЛЕЙН, С. Зміни жирової тканини та кінетики ліпідів печінки у чоловіків та жінок із ожирінням із неалкогольною жировою хворобою печінки. Гастроентерол. 134 (2): 424-431. 2008 рік.

10. НАЦІОНАЛЬНИЙ ФОНД НАУКИ, ТЕХНОЛОГІЇ І ІННОВАЦІЙ (FONACIT). Стандарт використання тварин у дослідженнях. В: Кодекс біоетики та біобезпеки. 3-е видання Каракаса, Венесуела. Pp 33-35. 2009 рік.

11. ГАНДЖІ, С.Х.; КУКЕС, Г.Д .; ЛАМБРЕХТ, Н.; КАШЯП, МЛ.; КАМАННА, В.С. Терапевтична роль ніацину у профілактиці та регресії стеатозу печінки у моделі безалкогольної жирової хвороби печінки у щурів. Am. J. Physiol. Гастроінтест. Фізіол печінки. 306 (4): G320-G327. 2014 рік.

12. ДЖАННІНІ, Є.Г .; ТЕСТА, Р .; САВАРІНО, В. Зміна ферментів печінки: Посібник для клініцистів. Пес. Мед. Доц. J. 172 (3): 367-379. 2005 рік.

13. ЛУПЕЗ-ОРТЕГА, А.А .; АРАНГУРЕН, А.Дж.; ПЛАЗА, М.А .; МУРІЛЛО, доктор медичних наук Окислювальний стрес та порушення функції печінки у самок мишей з експериментальною жировою печінкою. Преподобний ветеринар. 25 (1): 7-11. 2014 рік.

14. МАТО, Дж. М.; БВІЛА, М.А .; КОРРАЛЕС, Ф.Дж. Біосинтез S-аденозилметионіну. У: Carmel, R., Jacobsen, D.W. (Під ред.), Гомоцистеїн у здоров’ї та хворобах. Кембриджська університетська преса. Кембридж. Стор. 47-62. 2001 рік.

15. МАЙЕС, П.А. Транспортування та зберігання ліпідів. У: Мюррей, Р.К.; Граннер, Д.К .; Майєс, П.А .; Родвелл В. (Eds), Harper® Biochemistry. 25-е ​​видання, Appleton & Lange, Stamford. Pp 268-284; 130-136. 2000 рік.

16. НІТАНАЙ, А.; КАТОХ, Н.; ОЙКАВА, С.; САЙТО, М.; ХАМАДА, М.; КУЦУЗАВА, А.; МОХАМЕД, Т.; УЧІДА, Е .; ЕНДОХ, Д.; КУРОСАВА, Т.; SATO, H. Зниження концентрації аполіпопротеїну C-III у сироватці крові у корів з індукованою етіоніном жировою печінкою. J. Vet. Med. Sci. 66 (9): 1113-1118. 2004.

17. РОВЕРС, М, Кетоз у молочних корів і роль пагорба. М. Г. Мундо Ганад. 5 (257): 58-60. 2014 рік.

18. СИНГАЛ, А.К.; ДЖАМПАНА, С.К .; ВАЙНМАН, С.А. Антиоксиданти як терапевтичні засоби при захворюваннях печінки. Печінка. Інтернат. 31 (10): 1432-1448. 2011 рік.

19. СУТАР, В.С.; КАНЕЛАС-РАПОСО, Дж .; ВІД НІЗИ .; HEUWIESER, W. Поширеність субклінічного кетозу та взаємозв'язок із післяпологовими захворюваннями у європейських молочних корів. J. Dairy Sci. 96 (5): 2925-2938. 2013 рік.

20. ТАКАХАШІ, Ю.; СОЕЖІМА, Ю.; ФУКУСАТО, Т. Тваринні моделі неалкогольної жирової хвороби печінки/неалкогольного стеатогепатиту. Світ J. Gastroenterol. 18 (19): 2300-2308. 2012.

21. ОХКАВА, Х.; ОХІШІ, Н.; ЯГІ К. Аналіз на перекиси ліпідів у тканинах тварин реакцією тіобарбітурової кислоти. Аналітик. Біохім. 95 (2): 351-358. 1979 рік.

22. ВОЛЛІН, Б .; РОЗЕНГРЕН, Б .; ШЕРЦЕР, Ч.; CAMEJO, G. Окислення ліпопротеїнів та вимірювання утворення речовин, що реагують на тіобарбітурову кислоту, в одній мікропланшетній мікропланшеті: Його використання для оцінки антиоксидантів. Аналітик. Біохім. 208 (1): 10-15. 1993 рік.