Резюме

Доступ надано

Довіритель

Порівняно з генотипово HLA-ідентичною трансплантацією кісткового мозку (BMT), не пов’язаний трансплантат донора (URD) ​​пов’язаний з вищим рівнем смертності. Важка гостра хвороба трансплантат проти господаря (aGVHD) та недостатність трансплантата є головними причинами смертності, пов’язаної з трансплантацією (MRD), і можуть бути пов’язані зі ступенем несумісності HLA.1234

На додаток до молекулярної типізації, клітинні тести були розроблені для прогнозування впливу диспропорцій класу HLA на ймовірність aGVHD. Вони полягають у визначенні частоти донорських Т-клітинних цитотоксичних попередників (CTLp) із антирецепторною специфічністю (напрямок GVHD) .17 Низькі частоти CTLp сильно корелюють із сумісністю HLA-A та -B.811

Оскільки використання URD-BMT збільшилось із збільшенням обсягу реєстрів донорів, для покращення клінічної практики терміново потрібно більше даних з цієї теми, а ретроспективна оцінка попереднього досвіду залишається необхідною для кожної клінічної групи. Метою цього дослідження було визначити вплив розбіжностей класів HLA I та II на результат пацієнта після URD-BMT. Ми переписали HLA класів I та II, використовуючи методи ДНК із високою роздільною здатністю, в 69 парах донорів та реципієнтів, трансплантованих у вересні 1988 р. Та червні 1998 р. У нашій установі. Частоти CTLp також визначали у 33 з цих пар.

Матеріали і методи

Процедура BMT

До дослідження було включено 69 послідовних процедур URD-BMT, проведених у вересні 1988 року - червні 1998 року в університетській лікарні Генрі-Мондора (табл. 1). Троє хворих двічі були прищеплені. Донорів ідентифікували через європейські реєстри та NMDP. Основні характеристики пацієнтів до ІМТ узагальнені в таблиці 1. Пацієнтів розподілили на дві групи за станом захворювання у БМТ: 32 реципієнти з ХМЛ у першій хронічній фазі або гострий лейкоз у першій. стандартну групу ризику, а 37 пацієнтів із більш запущеним захворюванням при ІМТ сформували групу високого ризику.

Повний розмір таблиці

Перші 66 процедур BMT були проведені після мієлоаблативного кондиціонування, включаючи загальне опромінення тіла (n = 59) або режим на основі бусульфану (n = 7). Три другі трансплантати з іншим донором виконували після прокарбазину: циклофосфамід та антитимоцитарний глобулін. Профілактика GVHD поєднувала циклоспорин та метотрексат відповідно до протоколу Сіетла.18 Усі пацієнти отримували немодифікований кістковий мозок. Гострий РТПХ класифікували за визначенням Glucksberg et al. 19, і його лікували стандартними дозами стероїдів, за якими у разі відмови застосовували високі дози стероїдів або ATG.

Характеристика HLA та порівняння пацієнта-донора

Введення HLA Pre-BMT:

Донори були відібрані на основі типізації HLA-A та -B з використанням методики мікролінфітотоксичності20, визначаючи відповідні особливості, визнані Всесвітньою організацією охорони здоров’я (ВООЗ) на момент трансплантації. Типізацію HLA класу II проводили за допомогою технік, доступних на момент трансплантації. Тому фенотипи HLA-DR та -DQ вивчали при низькій роздільній здатності у 14 парах серологічно (n = 3) або RFLP (поліморфізм довжини рестрикційного фрагмента) (n = 11), тоді як в інших 55 парах HLA-DRB1 - Типізацію DQB1 та -DPB1 проводили з високою роздільною здатністю з використанням крапкової крапки ПЛР (Innogenetics, Брюссель, Бельгія) плюс PCR-RFLP2122 для HLA-DRB1 та -DQB1.

Ретроспективне написання HLA:

Типізацію HLA класу I проводили ретроспективно за допомогою PCR-SSP (специфічний для послідовності праймер) (Dynal, Осло, Норвегія).

Серологічні «заготовки» HLA-A та HLA-B повторно набирали за допомогою ДНК-типізації з низькою роздільною здатністю. Всі серологічно експресовані антигени HLA-A визначали на алельному рівні. Серологічно експресовані антигени HLA-B визначали з високою роздільною здатністю відповідно до наявності комерційних наборів (фенотип HLA-B був повністю визначений при високій роздільній здатності у 39 з 69 пар донорів-реципієнтів). Локус HLA-C вивчали за допомогою методики, що визначає алелі Cw1–18.

HLA-DRB1, -DQB1 та -DPB1 були переписані в 14 парах донор-реципієнт, які раніше були записані з низькою роздільною здатністю.

Розрахунок частот CTL-p

Аналізи CTLp проводили, як описано Kaminski et al. Коротко кажучи, аналізи проводили в "напрямі GVHD", причому клітини-донори використовувались як клітини-відповіді, а клітини-реципієнти як клітини-стимулятори. Колодязі оцінювали як позитивні, якщо їх вивільнення 51 Cr перевищувало середнє значення плюс 3 стандартні відхилення (SD) від негативного контролю (стимулятор клітин без клітин, що реагували). Частоти CTLp нижче 1/300000 вважалися негативними.8

статистичні методи

Дані були зібрані та оновлені станом на 15 листопада 1998 р., Забезпечуючи мінімальне спостереження за пацієнтом 7 місяців, максимум 122 місяці та медіану спостереження за вижилими 29 місяців (діапазон 7-122 місяців). Оцінені ймовірності aVVHD, MRT та виживання були розраховані та побудовані за методом Каплана-Мейєра та порівняні за допомогою тесту log-rank. Пацієнти, яким була проведена друга трансплантація, були піддані цензурі для першої трансплантації на дату другої BMT.

Результати

HLA типізація та частоти pCTL

На момент трансплантації було відомо, що шість пар донорів та реципієнтів не мають собі рівних щодо антигену HLA-A або -B (UPN 671, 588, 536, 620, 629, 643); дві пари - невідповідність HLA-DQB1 (UPN 495, 547), а одна пара - невідповідність HLA-A і -DQB (UPN 502) (таблиця 2).

Повний розмір таблиці

Ретроспективне типізування ДНК підтвердило всі серологічно виявлені невідповідності. Додаткові невідповідності були виявлені у семи з дев'яти відомих невідповідних пар донор-реципієнт (таблиця 2). Серед інших 60 пар донорів та реципієнтів невідомі несумісності HLA під час трансплантації були виявлені у 27/60 (45%), тоді як 33/60 (55%) пар підтвердили, що вони відповідають HLA. A, -B, -C, -DRB1 та -DQB1 алелі. Тому після ретроспективного друку загалом 36/69 (52%) пари донорів та реципієнтів не збігалися. Серед цих пар 27 лише не відповідали антигенам HLA класу I, п'ять одинарних пар не відповідали антигенам HLA класу II, а чотири не відповідали антигенам HLA класу I та II.

HLA клас I

Серологічно порожні фенотипи завжди підтверджувались типізацією ДНК із низькою роздільною здатністю, яка також показувала, що особа була помилково ідентифікована шляхом серологічного типізації (HLA-B57 (17) замість HLA-B58 (17) (UPN 502)). Серед 62 пар, яким під час трансплантації серологічно відповідали HLA-A та -B, невідповідність HLA-A та/або -B було виявлено у 13 після ретроспективного набору тексту (таблиці 2 та 3). Антигени HLA-B визначали шляхом типізації з високою роздільною здатністю у 17/33 відповідних парах донор-реципієнт і 22/36 невідповідних парах.

Повний розмір таблиці

Серед 69 пар 23 не відповідали HLA-C (таблиця 3). Десять мали невідповідність антигену HLA-C, тоді як 12 також мали невідповідність HLA-A та/або -B, а одна також мала невідповідність класу HLA II (таблиці 2 та 4). Всі молекули HLA-B були набрані з високою роздільною здатністю у всіх 10 парах, лише з невідповідністю HLA-C. Отже, після ретроспективного типування ДНК у 31/69 (45%) пар було принаймні одне невідповідність HLA класу I.

Повний розмір таблиці

HLA клас II

Серед 14 пар донорів та реципієнтів, які були фенотиповані з низькою роздільною здатністю на момент трансплантації, виявлено невідповідність шляхом ретроспективного набору тексту у шести передбачуваних парах донорів та реципієнтів класу HLA II; з них три були невідповідностями HLA-DQB1 (UPN 392, 441, 380), один - невідповідностями HLA-DRB1 та -DQB1 (UPN 373), а два - невідповідностями HLA класу I та класу II (UPN 426, 306) (таблиця 2). Таким чином, 9/69 пар донорів-реципієнтів не відповідали HLA класу II.

Типізація HLA-DPB1 показала, що лише дев'ять пар пацієнтів та донорів були збігаються з цього приводу. Загалом лише п’ять пар були ідентичними HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 та -DPB1.

Гаплотипи предків

Щоб визначити, чи можна передбачити частоту невідповідностей, виявлених при типізації ДНК з високою роздільною здатністю, на основі збережених гаплотипів, ми класифікували фенотипи HLA пар донорів-реципієнтів, виявлених на момент трансплантації, на основі ймовірної присутності один або два із 25 родових гаплотипів HLA-ABDR (AH), визначених Christiansen та співавт. 23. Наявність HA неможливо проаналізувати у восьми парах донорів та реципієнтів (сім з відомими невідповідностями HLA на момент трансплантації та одна з множинними невідповідностями, що перешкоджають відновленню гаплотипу). Дві пари можуть мати дві АГ, 29 одну АГ і 30 не АГ. Серед 122 проаналізованих гаплотипів невідповідність класу HLA класу I була частішою після типізації ДНК з високою роздільною здатністю в гаплотипах, які вважаються неродковими, ніж у HA (21/89 проти 2/33) (P = 0,017 за тестом Фішера).

Частоти CTLp визначали для 33 пар. Після типізації ДНК 14 пар були невідповідними HLA класу I у напрямі GVHD та 19 пар (Таблиця 5). Серед 14 невідповідних пар висока частота CTLp була виявлена ​​у дев'яти пар, а низька - у п'яти. З цих останніх п’яти пар дві були невідповідністю HLA-A (UPN 671, 547), одна - невідповідністю HLA-B (UPN 642) і дві - невідповідності HLA-C (UPN 680, 668). Низькі частоти CTLp були виявлені в 19 парах, зіставлених у напрямку GVHD.

Повний розмір таблиці

Приживлення

Шість пацієнтів померли до 30 дня після трансплантації, що означає, що можна було оцінити 63 трансплантати. Збій трансплантата стався у п’яти випадках. Чотири з п'яти пар були класом HLA класу I, невідповідні в напрямку HVG (хост проти трансплантата) (UPN 526, 436, 617, 536), і одна була порівняна. Двоє пацієнтів мали невідповідність антигену HLA-C (UPN 617, 436), одному - невідповідність антигену HLA-B (UPN 526), ​​а одному - невідповідність HLA-B та -C (UPN 536).

AGVHD, TRM та виживання

Дев'ятнадцять із 66 пацієнтів живі (медіана 28 місяців, діапазон 7-122 місяців після ІМТ), включаючи одного пацієнта з аутологічним відновленням (UPN 617) та одного пацієнта з рецидивом лімфоми (UPN 600). Загальний коефіцієнт виживання для всієї когорти становить 28 ± 6%, а значення корелюють з гематологічним статусом (55% проти 9%) (P

роздільною

Каплан-Мейєр оцінює виживання пацієнтів із "стандартним статусом ризику" (суцільна лінія) порівняно з пацієнтами з "статусом високого ризику" (пунктирна лінія). Імовірність виживання становила 55% для пацієнтів із "стандартним статусом ризику" та 9% для пацієнтів із "статусом високого ризику" (P

Оцінки виживання Каплана-Мейєра у пацієнтів, яким зробили відповідні трансплантації HLA класів I та II (суцільна лінія), порівняно з тими, хто отримав невідповідні трансплантації класів HLA I та II (пунктирна лінія). Ймовірність виживання становила 40% для пацієнтів, що відповідали збігу, і 20% для пацієнтів, які не відповідали (P

Ймовірність aGVHD ступеня III-IV у збіжних HLA (суцільна лінія) та невідповідних трансплантатах HLA (пунктирна лінія). Серед пацієнтів, яких можна оцінити на РТПХ, у 2/30 співпадаючих пацієнтів та у 16/33 невідповідних пацієнтів спостерігався тяжкий РПЗЗ (P

Оцінки виживання Каплана-Мейєра у пацієнтів, які отримували відповідні трансплантації класу HLA I та II класу (суцільна лінія), порівняно з тими, хто отримував відповідні трансплантації класу II HLA неспарених класів (пунктир). Ймовірність виживання становила 42% для відповідних трансплантацій класу HLA I та II та 18% для HLA класу I неспареного класу II (P

Порівняння оцінок виживання Каплана-Мейєра у чотирьох підгрупах: "стан стандартного ризику" та відповідні трансплантації; "стандартний статус ризику" та невідповідні трансплантації; "статус високого ризику" та відповідні трансплантації; "Статус високого ризику" та невідповідні трансплантації. Імовірність виживання становила 66%, 31%, 9% та 8% відповідно.

Повнорозмірне зображення

Обговорення

Наше дослідження чітко підтверджує, що виживання після URD-BMT можна покращити, комбінуючи донора та реципієнта HLA-A, -B, -C на високому рівні роздільної здатності, вказуючи на те, що несумісність HLA виявляється лише набором тексту. Висока роздільна здатність (тобто пропущена) за звичайними методиками) є клінічно значущими. Хоча це вже кілька років відомо про сумісність HLA класу II, це було встановлено лише для HLA класу I у двох недавніх дослідженнях.910 Наше дослідження показує високу частоту невідповідності класу HLA класу між HLA-A та -B серологічно ідентичним донором -пари одержувачів. Насправді алельні невідповідності HLA-A та/або -B були виявлені у 13/62 (21%) серологічно відповідних пар та у 6/7 (86%) пар, які, як відомо, не відповідали на момент трансплантації. Крім того, це дослідження підкреслює високу частоту невідповідності HLA-C (23/69, 33%), яка мала місце у 11/23 випадків без збігу HLA-A та/або -B.

Цікаво, що наш аналіз свідчить про те, що HA рідше асоціюються з аллельними диспропорціями класу HLA, згідно з дослідженням Prasad et al.12. Однак слід зазначити, що сегрегація HA базується на розрахунку ймовірності і не може бути визначена. на одного донора сімейних досліджень.

Нещодавно багато трансплантаційних одиниць запровадили тести CTLp з метою виявлення відсутніх невідповідностей класу HLA класу I або прогнозування aGVHD.8 У нашому центрі результати CTLp використовувались для відбору донорів перед трансплантацією, а донори з найвищими тестами CTLp були ліквідовані . У цьому дослідженні, коли порівнювали типізацію CTLp та ДНК, високі тести CTLp завжди асоціювались з невідповідністю класу HLA класу I. Однак негативні тести CTLp спостерігали у п'яти парах, незважаючи на невідповідність напрямку GVHD (включаючи три випадки з невідповідністю HLA-A або -B), що узгоджується з дослідженням Скотта та ін., 11 CTLp може бути корисним для виявлення HLA клас I невідповідність вседозволеності. Однак поява важкого aGVHD у двох із чотирьох пацієнтів із невідповідністю лише класу HLA класу та негативними тестами CTLp заважає нам підтвердити цю можливість.

На закінчення, геномна типізація алелів класу I та II HLA значно збільшує успіх трансплантації від неспоріднених донорів, при цьому медіана виживання у відповідній групі порівнянна з виживаністю при трансплантації гено-ідентичних братів і сестер. Поганий прогноз пацієнтів, які перенесли несумісну з HLA трансплантацію, свідчить про необхідність нових способів трансплантації.