СЕНС ІСТВАН УНІВЕРСИТЕТНИЙ ДОКТОР (доктор філософії) ВИЗНАЧЕННЯ ДИЗЕРТАЦІЇ, ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА РОЛЬ ПРОТОЗОНІВ В ЛЮДСЬКОМУ СЕРЕДОВИЩІ Orosz Erika Gödöll 2013
Назва докторської школи: дисципліна: Докторська школа екологічних наук Керівник природознавства: д-р Дьєрдж Хелтай, професор, д.т.н. Університет Сент-Іштвана Інститут екологічних наук MKK Департамент хімії та біохімії Науковий керівник: д-р Дьєрдь Фюлекі, професор, к.т.н. Університет Сент Іштван Інститут екологічних наук MKK Департамент ґрунтознавства та агрохімії Науковий керівник: доктор Баюмі Хамуда Хосам Доцент, к.т.н. Університет Обуда Інститут екологічних наук РКК схвалення керівника школи (д-р Дьєрдж Хелтай) . схвалення керівника (д-р Дьєрдь Фюлекі) . схвалення керівника (д-р Баюмі Хамуда Хосам)
RNA rpm sp., Spp. Tm Stock WB ВООЗ обороти рибонуклеїнової кислоти в хвилину Види Аналіз температури плавлення є запатентованим запасом, який не ідентичний або не пов'язаний з жодною національною або міжнародною юридичною особою, визнаною юридичною особою. Цей штам є лабораторно відібраним за імовірністю Всесвітньою організацією охорони здоров’я Western-Blot. Ймовірність називається рівнем значимості статистичного тесту (MANCZEL 1983, KEMÉNY та DEÁK 2000). Значення статистичної статистики потрапляють у діапазон прийнятності з імовірністю 1, якщо нульова гіпотеза відповідає дійсності. З іншого боку, діапазон прийнятності - це той, в якому значення статистичної статистики можуть мати ймовірність 1 через випадкові коливання. 4
ЗМІСТ СКОРОЧЕННЯ ТА СИМВОЛИ В ДИСЕРТАЦІЇ. 3 1 ВСТУП І ЗАВДАННЯ. 7 1.1 Актуальність та значення теми. 7 1.2 Цілі. 8 2 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ. 9 2.1 Еволюція. 9 2.2 Поширення найпростіших. 11 2.3 Захист від найпростіших. 12 2.4 Методи діагностики найпростіших. 12 2.4.1 Мікроскопічне дослідження найпростіших. 12 2.4.2 Селекційне дослідження найпростіших. 13 2.4.3 Імуносерологічне дослідження найпростіших. 14 2.4.4 Ізоферментне дослідження найпростіших. 16 2.4.5 Молекулярно-біологічне вивчення найпростіших. 17 2.5 Епідеміологія. 18 2.6 Визначення та ідентифікація рівня найпростіших видів. 19 2.6.1 Опис нових видів найпростіших. 19 2.6.2 Рід Ентамеби. 20 2.6.3 Рід Acanthamoeba. 29 2.6.4 Рід лямблій. 32 3 МАТЕРІАЛ І МЕТОД. 37 3.1 Відбір проб. 37 3.1.1 Entamoeba sp. походження зразків. 37 3.1.2 Acanthamoeba spp. походження зразків. 37 3.1.3 Походження зразків кишечника лямблій. 37 3.2 Виділення та ідентифікація найпростіших. 37 3.2.1 Мікроскопічне визначення Entamoeba histolytica та Giardia intestinalis. 37 3.2.2 Acanthamoeba spp. мікроскопічне визначення. 38 3.3 Культурні засоби. 38 3.3.1 Середовище Entamoeba histolytica. 38 3.3.2 Acanthamoeba spp. середній. 40 5
1.2. Мета виявлення Entamoeba histolytica у досліджуваних речовинах класичними та молекулярними методами (ПЛР) із використанням специфічної частини гена 16S-рРНК, кодованого в геномі паразита кукурудзи та ризосфери люцерни Acanthmoeba spp. Виявлення Acanthamoeba spp., Виділеного з ризосфери класичними та сучасними методами. Секвенування та ідентифікація видів Виявлення Giardia intestinalis з досліджуваних матеріалів за допомогою класичної вкладеної ПЛР з використанням специфічної частини гена 18S-рРНК, кодованого в геномі паразита 8
No1 електронна таблиця. Поява патогенних та факультативно-патогенних найпростіших в організмі людини. Балантій 10
No2 електронна таблиця. Кишечник Entamoeba spp. морфологічні характеристики (джерело: http://cmr.asm.org/content/16/4/713.full.pdf+html) 2.6.2.1 Entamoeba spp. морфологія Entamoeba histolytica Вид E. histolytica був описаний Лесом в 1875 р. в Санкт-Петербурзі, Росія, і названий Фріцем Шаудінном у 1903 р. (SAKLATVALA 1993). Живиться фагоцитозом, рухається за допомогою підборіддя, розмножується нестатевим шляхом. Відомі два прояви: рухливий, живлячий, відтворюючий трофозоїт 12-17 мкм (рис. 1) та циста, утворена міцною стінкою через несприятливі фактори навколишнього середовища 10 15 м (рис. 1.Б). 21
Entamoeba coli (Grassis, 1879) E. coli є апатогенним, поступаючись лише E. histolytica/E. dispar. Відомі два прояви: трофозоїт 20-40 мкм (рис. 2.А), який рухається, розмножується, харчується, відокремлення ендо- та ектоплазми не завжди можна виявити. У його плазмі ви можете бачити фагоцитарні гранули, вакуолі та насіння з периферичним хроматином в ядрах, що містяться у грубому, ексцентричному розташуванні. Рух трофозоїту дуже повільний, витончений (MILCH та JANKÓ 1990). Кіста оточена міцною стінкою на 15 30 м (рис. 2 Б), в яку кількість ядер зазвичай перевищує чотири, зазвичай вісім. Малюнок B 2. Entamoeba coli trophozoita (A) та cysta (B) Entamoeba hartmanni Як уже згадувалося, також відомі два прояви: переміщення, годування, розмноження трофозоїта 10-15 мкм (рис. 3.А) та циста 7-10 мкм (рис. 3). Рис. Б). Він апатогенний, абсолютно нешкідливий і не викликає хвороб навіть у людей із ослабленим імунітетом. Малюнок B 3. Entamoeba hartmanni trophozoita (A) та cysta (B) 23
Jodamoeba bütchli (Prowazek, 1911) Товста кишка, апатогенний трофозоїт 10-20 мкм (рис. 4.А), що мешкає в товстій кишці, мембрана її везикулярного ядра пов’язана з великим ядерцем тонкими хроматиновими хребтами. Рух трофозоїту носить прогресивний характер, як правило, із різким вітром у його плазмі - глюкогеновмісною вакуолею, яка з розчином Люголя набуває темно-коричневий колір. Кіста має одне або два ядра 7-15 4 м (рис. 4 Б), і завжди можна побачити велику вакуолю глікогену, яка з розчином Люголя набуває темно-коричневий колір (MILCH та JANKÓ 1990). Малюнок B 4. Jodamoeba bütchli trophozoita (A) і cysta (B) На малюнках, що належать до роду Enthamoeba (1A, B; 2A, B; 3A, B; 4A, B), вид можна вивчати на веб-сайті CDC (я використовував цифри, оскільки він представляв найбільш реалістичні результати, джерела: http://en.wikipedia.org http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/intestinalamebae.htm). 24
2.6.2.2 Entamoeba spp. життєвий цикл Рисунок 5. Життєвий цикл Ентамеби (джерело: http://en.wikipedia.org) Entamoeba spp. джерела зараження: вода, їжа, забруднена фекаліями, і брудні руки (я використав цей малюнок 5, оскільки він представляв найбільш реалістичні результати). 2.6.2.3 Життєвий цикл Entamoeba histolytica Проковтнуті цисти (HAQUE та ін., 2003) не пошкоджуються шлунковою кислотою, тому вони легко потрапляють у тонкий кишечник, де перетворюються на трофозоїти. Дрейфуючи з вмістом кишечника, вони досягають товстої кишки, де осідають на поверхні слизової, галактоза пов'язує галактозу N-ацетил-дгалактозамін за допомогою лектину, а потім лізує клітини слизової оболонки, стінки кишечника, пошкоджуючи тканини. ферменти та білки. Спочатку це набряк і 25
абсцеси з подальшим розвитком характерних глибоких виразок у формі пляшки в результаті некрозу (відмирання тканин). Джерела інфекції: Забруднення стільця або їжа Брудні води вода Рисунок 6. Життєвий цикл Entamoeba histolytica (джерело: http://en.wikipedia.org) Амебіаз, спричинений E. histolytica, в першу чергу характерний для тропічних та середземноморських районів (CAVALLO and GARRABÉ 2007, HERBINGER et al. 2011), інвазивний протозон в організм людини викликає загрожуючі життю кишкові та позакишкові захворювання. У позакишковій формі він може атакувати печінку (HOFFNER et al. 1999, ACUNA-SOTO et al. 2000), легені та інші ділянки тіла, перетинаючи бар’єр слизової оболонки кишечника (BADALAMENTI et al. 1999). Патогенна E. histolytica найчастіше потрапляє в організм людини немитими руками, забрудненою водою кіст, фруктами, забрудненими фекаліями людини, або арально-анальним сексуальним контактом (PHILLIPS et al. 1981, QUINN et al. 1981). 26
На думку деяких дослідників, патогенні штами Enthamoeba histolytica зустрічаються лише в тропічному або субтропічному кліматі (CLARK and DIAMOND 1991, SILBERMAN et al. 1999, DEBNATH et al. 2012), тоді як помірні пояси є апатогенними E. dispar (VÁRNAI 1987, HUSTON і PETRI 1999). В Угорщині його в основному залучають туристи та іммігранти з ендемічних районів (OROSZ та ін., 2012). Зараження відбувається через споживання фруктів, овочів або цист у напоях, забруднених фекаліями. (IDOWU AND ROWLAND 2006). При гострій діареї пацієнт, що захищається, прокачує безліч кіст (5x10 кожні 7 днів). 28