Резюме

Тут ми описуємо простий, недорогий і швидкий метод очищення для розв’язання тривимірної структури білої жирової тканини людини та миші за допомогою комбінації маркерів для візуалізації судин, ядер, імунних клітин, нейронів та білків шару ліпідних шарів за допомогою флуоресцентних зображень.

жирових

Анотація

Вступ

Ожиріння характеризується збільшенням маси жирової тканини і стало головною проблемою охорони здоров'я в усьому світі, оскільки люди з ожирінням мають підвищений ризик розвитку серцево-судинних захворювань, діабету 2 типу, захворювань печінки та деяких видів раку.

Основною фізіологічною функцією жирової тканини є модуляція гомеостазу глюкози та ліпідів у цілому 1, 2. Протягом періоду годування адипоцити (тобто основні клітини жирової тканини) зберігають надлишок глюкози та ліпідів, що забезпечуються їжею, у тригліцеридах. Під час голодування адипоцити розщеплюють тригліцериди до нестерифікованих жирних кислот та гліцерину, щоб підтримувати потребу організму в енергії. Під час розвитку ожиріння жирова тканина розширюється, збільшуючи розмір (гіпертрофія) та/або кількість (гіперплазія) адипоцитів 1, щоб збільшити його ємність зберігання. Коли розширення жирової тканини досягає своєї межі - дуже мінливої ​​константи серед пацієнтів, решта ліпідів накопичуються в інших метаболічних органах, включаючи м’язи та печінку 3, 4, що призводить до їх функціональної недостатності та ініціює пов’язані з цим серцево-метаболічні ускладнення. 1, 5. Тому виявлення механізмів, що регулюють розширення жирової тканини, є ключовою клінічною проблемою.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Цей протокол був протестований та затверджений для всіх відкладень мишей та білої жирової тканини людини. Жирові тканини людини та миші збирали відповідно до європейських законів та затверджували французький та шведський етичні комітети.

1. Фіксація жирової тканини білого кольору миші та людини

2. Проникнення і насичення білої жирової тканини миші та людини

3. Процедура фарбування жирової тканини білого кольору миші та людини

4. Процедура очищення жирової тканини білого кольору миші та людини

5.3D-конфокальне зображення прозорої білої жирової тканини

  1. Перенесіть тканину в металеву камеру для зображення, оснащену скляним дном (див Таблиця матеріалів)під хімічним витяжкою та наповніть камеру свіжим метилсаліцилатом.
    ПРИМІТКА.Щоб закріпити тканину на місці та запобігти її плаванню або зміщенню в боці в камері, нанесіть кілька круглих скляних кришок 18 мм Таблиця матеріалів)поверх тканини при кріпленні на камеру.
  2. Помістіть камеру зображення на перевернутий конфокальний мікроскоп.
  3. Зобразіть тканину за допомогою об'єктива з низьким збільшенням (наприклад, об'єктива в 4 рази), щоб сформувати 3D-карти на 3 см 3 всієї жирової тканини або зразка тканини людини.
  4. Виберіть кілька областей для відбору проб тканин із більшим збільшенням. Зазвичай використовують 20-кратний повітряний об'єктив, що забезпечує хороше співвідношення роздільної здатності та глибини. Ми отримуємо великі мозаїчні зображення із z-стеками глибиною від 600 до 2000 м.
    ПРИМІТКА: Використовуйте лінзу для далеких відстаней, щоб просвердлити тканину.

6. Вилучення кількісних результатів із 3D-зображень жирової тканини

ПРИМІТКА: Сегментація різних структур та подальший витяг кількісної інформації зі стопки тривимірних зображень, сформованих у пункті 5, можуть бути здійснені за допомогою будь-якої з багатьох існуючих опцій програмного забезпечення для аналізу зображень, комерційних чи безкоштовних. У наступних пунктах ми описуємо стратегію, яка зазвичай використовується в нашій лабораторії для отримання кількісної інформації із 3D-зображень жирової тканини за допомогою комерційного програмного забезпечення (див. Таблиця матеріалів).

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Використовуючи процедуру, описану тут та узагальнену на малюнку 1,ми змогли оптично забарвити та очистити білу жирову тканину людини та миші, як показано на малюнку 2А та малюнок 2B,відповідно. Прозора тканина була перенесена в металеву камеру візуалізації для конфокальної візуалізації (рис. 3А). Зазор різко покращив глибину зображень тканин, які ми змогли отримати (Рисунок 3B і малюнок 3С). Уся жирова тканина може бути придбана в 3D при малому збільшенні за допомогою 4-кратного об'єктива (див Додаткова плівка 1),згенерувати 3D-карту, що дозволяє вибрати різні ділянки для отримання з великим збільшенням за допомогою 20-кратного об'єктива (Рисунок 3D). Зображення із великим збільшенням отримуються у форматі 3D із глибиною 2 мм (Рисунок 3E).


Рисунок 1: Короткий огляд процедури очищення білої жирової тканини. Біла або мишача жирова тканина фіксована, пронизана, насичена, забарвлена ​​і прозора. Зображення отримують у форматі 3D та аналізують за допомогою комерційного програмного забезпечення. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Рисунок 2: Фотографії білої жирової тканини. (ДО) Фотографія жирової тканини білого черевного преса людини та до процедури відбілювання. (B) Фотографія мишоподібної білої жирової тканини до та після процедури очищення. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


Рисунок 5: Аналіз 3D-зображень із використанням комерційного програмного забезпечення (див. таблицю матеріалів). (ДО) 3D об'ємне представлення сегментованих людських адипоцитів у 3D за допомогою комерційного програмного забезпечення. Кожен адипоцит має інший колір, ніж його сусідні адипоцити, що контактують. Контейнери представлені червоним кольором. (B) Кількісна оцінка та розподіл розмірів адипоцитів за допомогою 3D об'ємного подання панелі A, яка містить близько 20 000 адипоцитів. (C.) 3D-об'ємне зображення судин, сегментованих у 3D із використанням комерційного програмного забезпечення та представлених червоним або жовтим кольором для великих та малих судин відповідно. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Додатковий фільм 1: 3D-рендерінг об’єму всієї підшкірної білої жирової тканини, показаний на малюнку 3D. Біла рамка представляє куб 2 см 3. Будь ласка, натисніть тут, щоб завантажити це відео.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не мають розкривати конфліктів.