Взаємозв'язок між цитотоксичною активністю та біоенергетичним метаболізмом сполук рослинного походження. Проект остаточного ступеня [Пишіть тут] Пабло Фуентес Ороско Біологічний факультет. Севілья, 2015 рік

язок

Батькам і сестрі за те, що вони мотивували мене і вірили в мене з моменту, коли я розпочав цей проект, який називався кар’єрою. Моїй матері, дякую за ту прихильність, яку ти передаєш мені, і за те, що ти вклав у мене всю свою пристрасть. Батькові, дякую за те, що ти навчив мене, що таке мужність, і тому, що ніхто не вміє слухати так, як ти. Я хотів би подякувати своєму репетитору Хав'єру Авілі, дякую за те, що ви мене терплячим і духом скерували, а також Олені Талеро, Азахарі Родрігес та Антоніо Алкаїде за кожен підбадьорливий жест і за те, що ви надали свій час у моє розпорядження. Нарешті, і не менш важливо, завдяки кожному з друзів, які були зі мною ці роки, першим і останнім, хто прибув, кожному божевільному, хто робить мій день, і всім, хто слухав і підтримував мене, коли мене немає. не було нікого. Дякуємо, що зробили групу друзів сім’єю. Дякую Калізе. Якщо вам щось дійсно цікаво, боріться за це. Якщо ви вдарилися об стіну, пройдіть крізь неї! Існує щось, що ви повинні знати про невдачу, і ніколи не дозволяйте йому бити вас. (Капітан пікша)

ІНДЕКС Скорочення резюме i ii I. ВСТУП 1 1. Оксиліпіни у рослинному царстві 1 1.1. Ясмонати. Біологічні функції 2 1.2. Метилжасмонат як засіб з протипухлинною активністю 3 2. Оксиліпіни в Царстві тварин 5 3. Сучасний стан раку 6 II. ЗАВДАННЯ 8 III. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 9 1. Використаний матеріал 9 1.1. Метилжасмонат 9 1.2. Культури клітин 10 2. Дослідження in vitro 11 2.1. Оцінка цитотоксичної активності метилжасмонату 11 2.1.1. Сульфородамін B 11 метод

2.2. Дослідження біоенергетичного метаболізму 12 2.2.1. Кількісна оцінка АТФ 14 2.3. Оцінка протизапальної активності метилжасмонату 14 2.3.1. Виробництво фактора некрозу пухлини-альфа 14 3. Статистичний аналіз 15 IV. РЕЗУЛЬТАТИ 16 1. Цитотоксична активність метилжасмонату 16 2. Цитотоксичні механізми. Вплив на біоенергетичний метаболізм 19 3. Протизапальна активність метилжасмонату 21 V. ОБГОВОРЕННЯ 23 VI. ВИСНОВКИ 27 VII. БІБЛІОГРАФІЯ 28

Скорочення А.А. арахідонової кислоти АДФ аденозин бісфосфат AJ жасмонової кислота Аналіз ANOVA дисперсионного АТФ аденозинтрифосфат CJ цис-жасмонат СОХ циклооксигеназа DEX дексаметазон DHA докозагексаєнової кислота ДМСО диметилсульфоксид ІФ аналіз з допомогою раку імуно-поглинань ICENIC кислоти міжнародних досліджень онов антиреверсу фермент-зв'язаного фермент ЕРА 50 пригнічують концентрація 50 IL інтерлейкін J2 метил 4,5-дидегідрожасмонат J7 метил 5-хлор-4,5-дидегідроясмонат LLC хронічний лімфолейкоз LOX ліпоксигеназа LPS ліпополісахарид MJ метил ясмонат ВООЗ Всесвітня організація охорони здоров'я OPDA 12-оксо-оксифтофосфат оксифторид фосфату PMA форбол ацетат миристат АФК киснево-реактивний вид SRB сульфородамін B TCA трихлороцтова кислота THP-1 гострий лейкоз людини моноцити лінія TNF-α фактор некрозу пухлини альфа TRAIL TNF-α 2-DG пов'язаний апоптоз, що викликає ліганд 2-дезокси-D-глюкоза i

Рисунок 1. Біологічні функції язмонатів та їх передача сигналів, опосередкованих біотичними та абіотичними процесами. 1.2. Метилжасмонат як засіб з протипухлинною активністю. MJ - це природний циклопентанон (рис. 2), який належить до сімейства оксиліпінів як гормони рослинної реакції на стрес (Liechti and Farmer, 2002). Його виробництво індукується різними типами абіотичних сигналів навколишнього середовища (УФ-випромінювання, осмотичний стрес та коливання температури) та біотичних (патогени, рослиноїдні тварини) (Ryals et al., 1996; Beckers and Spoel, 2006; Van der Ent et al., 2009) та опосередковує сигналізацію, яка активує захисні реакції проти цих типів стресу (Васюкова та ін., 2009). Окрім того, що він діє як вторинний метаболіт рослини, індукуючи захист рослин, MJ має помітний ефект на ракові клітини ссавців (Авдіушко та ін., 1995; Kato та ін., 1993; Melan та ін., 1993; Fingrut та Flescher, 2002 ). Ясмонати змінюють мітохондріальну функцію рослини і індукують утворення активних форм кисню (АФК), що призводить до загибелі клітин у шляху, подібному апоптозу у ссавців (Soares et al., 2010; Zhang and Xing, 2008). Встановлено, що у МЮ є 3

II. ЗАВДАННЯ Рослинні ясмонати продемонстрували задовільну біологічну активність у галузі раку завдяки їх цитотоксичним механізмам, пов'язаним з індукцією загибелі клітин у різних лініях раку людини. Метил-ясмонат (MJ) виявився корисним у синергетичній комбінації з препаратами, які в даний час використовуються при раку прямої кишки та певних клітинних лініях лейкемії. Отже, основною метою цього експериментального проекту остаточного ступеня було оцінити потенційну біологічну активність (протиракову та протизапальну) MJ, оксиліпіну рослинного походження. Тому ця робота зосереджена на кількох конкретних цілях: 1. Вивчити цитотоксичну активність чистої сполуки MJ на моноцитарній лінії гострого лейкозу людини (THP-1) як у моноцитному, так і в макрофагальному стані. 2. Оцініть, чи впливає цитотоксичний механізм на біоенергетичний метаболізм клітин THP-1 у станах моноцитів та макрофагів. 3. Вивчити протизапальну активність шляхом вивчення ефективності MJ на продукцію цитокіну TNF-α у клітинах THP-1, трансформованих у макрофаги. 8

III. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 1. ВИКОРИСТАНИЙ МАТЕРІАЛ 1.1. Метил-жасмонат Для виконання цієї роботи був використаний метил-ясмонат (Sigma-Aldrich Química, S.L. Іспанія), який витримували в темних умовах і зберігали при 4 ° C. Для використання цей продукт був приготований в диметилсульфоксиді (ДМСО) у концентрації 4400 мМ. Різні концентрації для дослідження проводили за допомогою відповідних розведень із повноцінним культуральним середовищем та подальшої обробки ультразвуком у ванні при кімнатній температурі для правильної гомогенізації. У будь-якому випадку, відсоток DMSO у культурах клітин становив менше 1% для забезпечення життєздатності клітин. робота. Таблиця 1. Номенклатура та структура чистого з'єднання MJ, з яким було проведено цей 9

1.2. Клітинні культури Клітинною лінією, яка використовувалась для цієї роботи, була клітинна моноцитна клітина гострого лейкозу людини, THP-1, люб’язно надана професором Франциско Муріаною з Інституту Грасу в Севільї (Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Севілья) до групи молекулярної та прикладної фармакології (FARMOLAP), в якій проведена більша частина цієї роботи. Клітини культивували при 37 ° С, в атмосфері з 5% СО2 і високою вологістю, в середовищі RPMI 1640 з 2 мМ L-глютаміном та 25 мМ HEPES (GIBCO, США), доповненою 10% плодовою телячою сироваткою (PAA) та 100U/л пеніциліну/стрептоміцину (PAA). Цю клітинну лінію підтримували у своєму моноцитарному стані (ріст суспензії) або її диференціювання до макрофагів (адгезивний стан) індукували РМА (0,2 мкм) протягом 72 год. Малюнок 3. Лінія гострого лейкозу людини THP-1, яка спостерігається під мікроскопом інвертованого світла. Клітини THP-1 у моноцитарному стані з метою 10X (A); Клітини THP-1 у стані макрофагів із ціллю 40X (B). 10

Метод SRB використовувався, головним чином, для вибору нецитотоксичних доз MJ для подальших досліджень клітинної сигналізації та експресії цитокінів. Рисунок 4. Протокол, який дотримується у методі сульфородаміну B. 2.2. Вивчення біоенергетичного метаболізму Для вивчення енергетичного обміну на клітинах, оброблених MJ, проводили оцінку концентрацій АТФ у різних дозах MJ, що використовувались. Цю оцінку проводили на клітинній лінії THP-1 як у стані макрофагів, так і в стані моноцитів. У макрофаговому стані це було проведено шляхом висіву 10000 клітин в кінцевому обсязі 100 мкл на лунку. Для цього використовували стерильні пластини 96-12 NUNC.