шлунково-кишкового

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • TNBS викликав коліт та погіршення пам’яті у мишей
  • ЕК погане навчання та погіршення пам'яті у мишей
  • LJ ослаблює TNBS- або EC-індукований коліт та погіршення пам'яті у мишей
  • TNBS та EC змінювали склад мікробіоти кишечника
  • LPS, виділений від прискореного порушення пам’яті EC у мишей
  • Обговорення
  • Методи
  • Приєднання
  • Файл читання послідовності
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткова інформація

Предмети

  • Імунна пам’ять
  • Інфекція
  • Запальна хвороба кишечника
  • Мікробіота

Резюме

Вступ

Широкі та інтенсивні двонаправлені мережі між мікробіотою кишечника та центральною нервовою системою (ЦНС) підтримуються через ендокринні, нервові та імунні шляхи. 1, 2 Вплив стресу, такого як патогенні мікроорганізми, стимулює мозок виділяти гормони, такі як кортикотропін-рилізинг-фактор, через гіпоталамо-гіпофізарно-надниркову вісь, які порушують мікробіоти кишечника, проникність та бар’єрну функцію та збільшують продукцію ендотоксинів такі як ліпополісахариди (LPS). 3, 4 Крім того, ці ендотоксини, які є частинами хімічних компонентів бактерій, стимулюють імунну реакцію кишечника та обмежують секрецію нейромедіаторів серотоніну та катехоламінів. 5, 6, 7 Ці нейромедіатори, цитокіни та гормони сприяють зв’язку між кишковою імунною системою (пов’язаною з мікробіотою кишечника) та ЦНС та підтримують гомеостаз. 5, 6 Порушення регуляції цих сигналів призводить до коліту, аутизму та ожиріння. 8, 9

У цьому дослідженні, оскільки стрес може викликати рівень ЛПС через коліт, а оскільки ЛПС може впливати на функції ЦНС, ми перевірили нашу гіпотезу про те, що індуктори коліту можуть спричиняти запалення шлунка та погіршення пам’яті, змінюючи склад кишкової мікробіоти, і ми досліджували, чи є коливання складу кишкової мікробіоти за допомогою індуктора коліту може посилити коліт та порушення пам’яті у мишей.

Результати

TNBS викликав коліт та погіршення пам’яті у мишей

L. johnsonii (LJ) ослаблює коліт та погіршення пам'яті, спричинені 2,4,6-тринітробензолсульфоновою кислотою (TNBS). Навчання та пам'ять поведінки оцінювались у завданні Y-maze ( до ). Експресію нейротрофічного фактора, отриманого з мозку (BDNF), та активацію ядерного фактора (NF) -κB вимірювали в гіпокампі за допомогою імуноблотингу ( b ). Рівні ліпополісахаридів у крові (LPS) вимірювали за допомогою аналізу Limulus ( c ). Рівень крові ( d ) та фактор некрозу пухлини гіпокампа (TNF) -α ( і ) вимірювали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). Маркери коліту, включаючи вкорочення товстої кишки ( F ), активність мієлопероксидази товстої кишки (MPO) ( g ) та активація NF-κB, а також індукована експресія синтази оксиду азоту (iNOS) та циклооксигенази (COX) -2 ( h ) та експресію білка (i), що міцно зв'язується, вимірювали в товстій кишці. Ці значення вказують на середнє значення ± sd (n = 10). * P

Вплив 2, 4, 6-тринітробензенсульфонової кислоти (TNBS), кишкової палички (EC) та L. johnsonii (LJ) на склад кишкової мікробіоти у мишей. Вплив на тип ( до ) та сімейний рівень ( b ). Співвідношення протеобактерій до твердих речовин (P/F) ( c ), Бактероїдети до твердих речовин (B/F) ( d ) та протеобактерії a Bacteroidetes (P/B) ( і ), були проаналізовані шляхом секвенування бактеріальних фрагментів 16S рРНК ( d ) ( F ) Таблиця основного аналізу координат (PCoA). Графік показує схему кластеризації між мишами, обробленими лише носієм (NOR), лише TNBS, лише EC, LJ у присутності EC (EC + LJ) на основі парнозваженого аналізу Fast UniFrac. Вплив на кількість ентеробактерій ( g ) та біфідобактерії + лактобактерії ( h ) вимірювали за допомогою селективної культури медіа. Чорні, сірі та білі смуги в ( g ) вказують на склад EC, K. pneumoniae та P. mirabilis відповідно. Ці значення вказують на середнє значення ± sd (n = 5). * P

Методи

Культура бактерій кишечника. LJ та EC, виділені з мікробіоти кишківника мишей, культивували на бульйоні GAM (BD, Radnor, PA) та селективних середовищах MRS (BD), BL та DHL (Nissui Pharm, Токіо, Японія). Коротко, LJ та EC культивували в 0,5 мкл відвару GAM при 37 ° C (оптична щільність при 600 нм, 1,0-1,2), збирали центрифугуванням (5000 g протягом 20 хв) і промивали двома сольовими розчинами. Зібрані клітини (5 х 10 9 КУО мл -1) суспендували у сольовому розчині (для клітинних експериментів, нагрітому при 72 ° С протягом 30 хвилин) або 1% глюкози (для перорального введення мишам).

Для аналізу мікробіоти кишечника селективними середовищами вміст свіжої товстої кишки (∼ 0,1 г) збирали з кожної групи у стерилізовані пластикові стаканчики, обережно суспендували в 9 обсягах середовища для розведення, поступово розводили 10 разів і засівали безпосередньо на агарові пластинки із середовищем печінки крові (BL, Bifidobacteria/Lactobacillus селективне середовище, Nissui Pharm) та лактозою гідросульфатним середовищем (DHL, Enterobacteriaceae селективне середовище, Eiken Chem, Токіо, Японія). 41 агаровий планшет DHL вирощували аеробно протягом 1 дня при 37 ° C, а агаровий планшет BL - анаеробно протягом 3 днів при 37 ° C.

LJ та EC були відібрані з колоній, що вирощуються в основному в BL та DHL, відповідно, і ідентифіковані за допомогою плями Грама, тесту на використання цукру (API 50 CHL або API 20 E Kit, bioMerieux, Сеул, Корея) та послідовності 16S рРНК (ABI DNA Аналіз 3730XL). Вони були передані в короткочасний файл Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) з номерами доступу KY751910 та KY751911.

Культура клітин Caco-2. Клітини Caco-2 купували у Korea Cell Line Bank (Сеул, Корея) і вирощували при 37 ° C в атмосфері 5% CO2 -95% повітря в DMEM (Sigma), що містить 10% плодової бичачої сироватки та 1% антибіотиків. протигрибковий. . Для вимірювання впливу LJ на експресію закритих зв'язуючих білків in vitro клітини обробляли 100 нг мл-1 фекальної фракції LPS у присутності або відсутності LJ протягом 24 годин і рівні експресії зв'язуючих білків закривали в Лізат вимірювали за допомогою імуноблотингу.

Тварини RaonBio постачав самців мишей ICR (25–27 г, віком 5 тижнів). (Кенгі-до, Корея). Усі миші були розміщені в дротяних клітках при температурі 20–22 ° C і вологості 50 ± 10%, їх годували стандартними лабораторними кормами та водою ad libitum. Мишей використовували в експериментах після акліматизації більше 1 тижня. Кожна група у всіх експериментах складалася з 10 мишей.

Усі експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з догляду та використання лабораторних тварин при Університеті Кюнг Хі та проводились відповідно до Керівних принципів догляду та використання лабораторних тварин Університету Кюнг Хі (номер IRB KHUASP (SE) -15-092).

Підготовка експериментальних колітичних мишей. Для приготування мишей з індукованим TNBS колітом інтраректально вводили 2,5% (мас./Об.) Розчин TNBS (100 мкл, розчинений у 50% етанолі) у товсту кишку мишей, знеболених ефіром 43 (додаткова фігура S6a). Щоб повністю розподілити TNBS у товстій кишці, мишей утримували у вертикальному положенні протягом 30 с після обробки TNBS. Звичайну контрольну групу лікували фізіологічним розчином замість TNBS. Мишей вбивали через 24 години, 8-й день та 15-й день після лікування TNBS.

Для приготування індукованого ЕК коліту мишам перорально вводили суспензію ЕК (1 × 10 9 КУО, суспендовану в 100 мкл 1% глюкози) один раз на день протягом 5 днів (додатковий малюнок S6b). Нормальну контрольну групу лікували 1% глюкозою замість ЕК. Мишей вбивали через 24 години, 8-й день та 15-й день після лікування ЕК.

Для приготування погіршення пам'яті, спричиненого LPS, мишам вводили внутрішньочеревно розчин LPS (8 мкг кг -1, розчинений у фізіологічному розчині) один раз на день протягом 10 днів (Додаткова фігура S6c). LPS був ізольований від EC. Нормальну контрольну групу лікували 1% глюкозою замість ЕК. Мишей вбивали через 48 годин після остаточного введення ЛПС.

Завдання пасивного уникнення. Завдання пасивного уникнення виконувалось у акриловій коробці з двома відділеннями, підключеною до освітленого відсіку (20 × 20 × 20 см) до темного відділення (20 × 20 × 20 см) за допомогою вхідного отвору (5 × 5 см) відповідно до метод Юнга та ін. 44 Коротко, у дослідженні придбання миші поміщали в освітлене відділення на 1-й, 8-й і 15-й день після обробки TNBS, EC або його LPS, і коли миша потрапляла в темну камеру, ток струму 0,3 мА протягом 2 с давали через підлогові сітки. Випробування на утримання проводили через 24 години після випробування на придбання та вимірювали час затримки для повторного входу в темну камеру.

Завдання Y-лабіринт. Y-лабіринт виконували в горизонтальному лабіринті з трьома руками (довжиною 40 см і шириною 3 см зі стінками висотою 12 см), в якому руки симетрично розташовані під кутом 120 ° один від одного згідно з методом Jung et до. 44 Лабіринтну підлогу та стіни виготовляли з темного непрозорого полівінілового пластику. Спочатку мишу поміщали в одну руку на 1-й, 8-й та 15-й день після обробки TNBS, EC або його LPS, а послідовність (тобто ACABC та ін.) Та кількість записів у руку реєстрували вручну для кожної миші протягом 8 хв. Фактичне чергування було визначено як входження у всі три групи за послідовним вибором (тобто ABC, CAB або BAC, але не ABA). Руки лабіринту ретельно очищали між завданнями, щоб видалити залишковий запах. Чергування (%) вказувалося наступним чином: чергування (%) = [(кількість чергувань)/(кількість загальних входів у руки - 2)] × 100. Кількість входів у руки, що слугувало показником рухової активності.

Аналіз активності MPO. Товсту кишку миші гомогенізували в 10 м М фосфатному буфері калію (рН 7,0), що містить 0,5% гексадецилтриметил амонію броміду, і центрифугували протягом 10 хв при 20000 г при 4 ° С. 45 Супернатант (50 мкл) додавали до реакційної суміші (0,1 м MH 2 O 2 та 1,6 м М тетраметилбензидину), інкубували при 37 ° C протягом 2 хв, а потім періодично контролювали поглинання при 650 нм протягом 5 хв. Активність МРО розраховували як кількість ферменту, що розкладає 1 мкмоль мл -1 перекису, і виражали в одиниці на мг білка.

Імуноферментний аналіз та імуноблотинг. Товсту кишку миші або гіпокампу гомогенізували в буфері для лізису RIPA, що містить 1% коктейлю інгібітора фосфатази та 1% коктейлю інгібітора протеази на льоду, і центрифугували при 15000 g при 4 ° C протягом 15 хв. Культивовані клітини Caco-2 гомогенізували в буфері для лізису RIPA, що містить 1% коктейлю-інгібітора фосфатази та 1% коктейлю-інгібітора протеази на льоду. Рівні цитокінів у супернатантах вимірювали за допомогою набору імуноферментних аналізів (Ebioscience, Atlanta, GA).

Для імуноблотингу супернатанти гомогенатів товстої кишки та культивованих клітин піддавали електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі та переносили на нітроцелюлозну мембрану. 45 Білки зондували антитілами, виявляли кон'юговані з пероксидазою хрону вторинні антитіла та візуалізували за допомогою набору для виявлення ECL.

Аналіз лімулу амебоцитів лімуту. Вміст ендотоксину в крові та фекаліях визначали за допомогою діазо-зв’язаного кінцевого лізату амебоцитарних лізатів (Cape Cod, E. Falmouth, MA) за методом Kim et al. 41 Коротко кажучи, для визначення концентрації ендотоксину в крові плазму розводили у безпірогенній воді в 10 разів, інактивували при 70 ° C протягом 10 хв, а потім інкубували з лімулом амебоцитарного лізату протягом 30 хв при 37 ° C. Додавання реагентів призвело до утворення похідного фуксину, який поглинає світло при 545 нм.

Для визначення концентрації ендотоксину в калі 20 мг калу з товстої кишки поміщали в 50 мл PBS в безпірогенну пробірку і обробляли ультразвуком на 1 год на льоду. 41 Після центрифугування при 400 g протягом 15 хв збирали верхні 30 мл, стерилізували фільтруванням через фільтр 0,45 мкм з наступною повторною фільтрацією через 0,22 мкм фільтр і інактивували протягом 10 хв при 70 ° С. Відфільтрований ультразвук використовували для визначення ендотоксину.

Статистичний аналіз. Дані вказуються як середнє значення ± sd Статистичний аналіз даних проводили з дисперсійним аналізом та тестом Дункана. Відмінності з Р