Предмети

Резюме

Вступ

Відомо, що етіологія ожиріння пов’язана з утворенням внутрішньоклітинних ліпідів, надмірним накопиченням адипоцитів та накопиченням жирової тканини в організмі як наслідок порушення регуляції енергетичного гомеостазу 1. Це метаболічне захворювання може легко збільшити ризик смерті через виникнення різних розладів та ускладнень, таких як діабет 2 типу, гіпертонія, гіперліпідемія, інсульт, серцево-судинні захворювання, опорно-руховий апарат та рак товстої кишки тощо. два. В останнє десятиліття рівень надмірної ваги та ожиріння зріс у всьому світі і стає генералізованою епідемією 3, незважаючи на розробку ряду клінічних препаратів проти ожиріння для контролю маси тіла за рахунок зменшення споживання їжі, збільшення витрат енергії та змін. Про метаболізм або регуляцію гормонального гомеостазу 4, 5. Тому пошук ефективних терапевтичних підходів проти ожиріння залишається проблемою.

Rhizoma Attraylodis Macrocephalae (RAM), відоме традиційне рослинне ліки, яке широко застосовується у Східній Азії як травний, сечогінний та антигідротичний засіб, являє собою корінь Attraylodes Macrocephala Koidz 13. Попередні дослідження також повідомляли, що ADR та його основні сполуки можуть чинити різноманітні фармацевтичні ефекти на експериментальних моделях, включаючи протиракову пухлину 14, антигепатотоксичність 15, антикоагулянт 16, противиразкову хворобу 17, антиоксидант 18, протизапальну дію 19, та антиадипогенез 20. Дослідження показало, що водний екстракт оперативної пам'яті може чинити ефект ожиріння завдяки модульованому інгібуванню накопичення ліпідів шляхом Akt/PI3K. Крім того, повідомляється, що RAM, ферментований Bacillus licheniformis, захищає кишкову бар’єрну функцію від ендотоксину 18, що узгоджується з благотворним впливом пробіотиків та опосередкованого пробіотиками бродіння на терапевтичну ефективність трав 18, 21. Однак до цих пір не було повідомлено про детальні дослідження, що оцінювали б питання про те, чи може взаємодія між ADR та пробіотиками чи мікробіотою кишечника модулювати вплив ADR на ожиріння.

Оскільки було встановлено, що процес бродіння рослинних препаратів підвищує їх терапевтичну ефективність проти різних захворювань, 12, 18, 22 ми припустили, що ферментовані трави можуть бути ефективнішими, ніж неферментовані трави проти метаболічних розладів. У поточному дослідженні, використовуючи щурів, яких годували клітинами HFD та 3T3-L1 як моделі in vitro та in vivo, ми спробували визначити, чи пов’язаний вплив ADR проти ожиріння із змінами в мікробному середовищі кишечника та чи ферментована оперативна пам’ять Lactobacillus plantarum (FRAM) у поєднанні з цим пробіотиком може мати більший вплив на ожиріння порівняно з неферментованою RAM (URAM). Крім того, оскільки відомо, що запалення низького ступеня тяжкості пов’язане з розвитком та появою ожиріння 23, 24, ми також оцінили протизапальний ефект двох згаданих вище рослинних препаратів, використовуючи щурів та клітинні лінії RAW 264,7, як in vivo та моделі in vitro для з'ясування ймовірних молекулярних механізмів, за допомогою яких вони можуть здійснювати ефекти ожиріння.

Результати

URAM та FRAM не впливали на життєздатність клітин за переважаючих експериментальних умов

Лікування URAM та FRAM у різних концентраціях (100, 200 та 400 мкг/мл) протягом 24 год не суттєво впливало на проліферацію клітин RAW 264,7, 3T3-L1 та HCT 116 порівняно з відповідною нормальною групою (рис. S1).

URAM та FRAM змінювали масу тіла та жир щурів, які отримували HFD + LPS

Лікування HFD та HFD плюс LPS у щурів призводило до значного збільшення маси тіла та маси черевної, епідидної та загальної жирових тканин порівняно з нормальною групою (P 25, 26 і що збільшення чутливості до інсуліну може призвести до зменшення 27, 28, 29 Ці результати спонукали нас розширити наше дослідження, щоб оцінити, чи може URAM або FRAM покращити чутливість до інсуліну (виміряну в показниках споживання глюкози) в нормальному або резистентному до інсуліну стані. проводили in vitro з використанням клітин L6 та HepG2 як моделей з останніми клітинами, обробленими глюкозаміном, щоб зробити їх резистентними до інсуліну. В якості еталону використовували метформін, пероральний протидіабетичний препарат, який покращує чутливість до інсуліну. Наші результати показали, що індуковані як URAM, так і FRAM значне збільшення поглинання глюкози в клітинах L6 (рис. S5A та S5B) або Hep G2 стійкий до інсуліну (рис. S6A та S6B) залежно від концентрації, припускаючи, що підвищена чутливість до інсуліну може бути чинником, завдяки якому URAM або FRAM можуть чинити антипіпогенну дію.

URAM та FRAM пригнічували LPS-індуковане утворення NO в клітинах RAW 264,7

Обробка LPS призвела до помітного збільшення виробництва NO в клітинах RAW 264,7 (P

кореневище

(A) Після закінчення експериментальної програми тварини голодували протягом 12 годин з доступом до води ad libitum. Згодом тваринам перорально вводили 1,0 мл розчину лактулози-манітол (що містить 66 мг/мл лактулози та 50 мг/мл манітолу). Після ще 20 годин голодування відбирали зразки сечі для визначення рівня лактулози та манітолу, як описано в розділі Матеріали та методи. Дані виражаються як відношення лактулози до маніту. (B) Після завершення експериментальної програми тваринам зробили кров і визначили рівень ендотоксинів у сироватці крові, як описано в розділі Методи. Дані виражаються як середнє значення ± SD (n = 8). Дані з різними літерами суттєво відрізняються (с

Після завершення експериментальної програми тваринам зробили кров і визначали рівень запальних цитокінів у сироватці крові, як описано в розділі Методи. Дані виражаються як середнє значення ± SD (n = 8). Дані з різними літерами суттєво відрізняються (с

(A) Після закінчення експериментальної програми тварини голодували протягом 12 годин з доступом до води ad libitum. Після додаткових 20 год голодування збирали зразки калу та аналізували фекальні мікробні спільноти шляхом денатураційного градієнтного гель-електрофорезу, як описано в розділі Методи. (B) PCA даних проводили на основі матриці відстані (двовимірної матриці) для подальшої оцінки подібності між бактеріальними спільнотами.

Повнорозмірне зображення

Після закінчення експериментальної програми тварини голодували протягом 12 годин з доступом до води ad libitum. Після ще 20 год голодування відбирали зразки калу та визначали кількість гена 16S рРНК у бактеріальних штамів, як описано в розділі Методи. Результати виражаються як нормовані значення кратності щодо нормальної групи. Дані виражаються як середнє значення ± SD (n = 8). Дані з різними літерами суттєво відрізняються (P 38. Однак відсутність знань та адекватних наукових доказів для пояснення механізму дії обмежує популяризацію та застосування цих препаратів. За допомогою різних експериментальних моделей попередні дослідження показали ефекти Лікарські засоби Rhizoma Attractiveylodis Macrocephalae (RAM) проти різних захворювань, включаючи ожиріння 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 .

Сприятливий вплив пробіотиків та їх ферментованих харчових продуктів на здоров'я добре задокументовано 39. Показано, що процес бродіння покращує біологічні властивості рослин, овочів та трав 18, 22, 40, 41, 42. Поточне дослідження було проведене для розуміння детальних молекулярних механізмів, що лежать в основі впливу ОЗУ на ожиріння, використовуючи експериментальні моделі in vivo та in vitro. Крім того, ще однією метою нашого дослідження було визначити, чи властивість АДР проти ожиріння пов'язане зі зміною мікробного середовища кишечника і чи може АДР, ферментований Lactobacillus plantarum у поєднанні з цим пробіотиком, мати більший ефект проти ожиріння порівняно з ADR. Ферментований.

Кілька попередніх досліджень припустили, що мікробні метаболічні взаємодії господаря та кишечника можуть відігравати важливу роль у схильності до ожиріння, 43, 44, 45, що зумовлене збільшенням енергозберігаючої здатності дієти та індукцією низького рівня. Хронічне системне запалення 46, 47, 48, 49. Наші результати показали суттєво підвищений рівень ендотоксину в сироватці крові, TNF-α та IL-6 у тварин, які харчувались HFD дієтою протягом восьми тижнів, порівняно з тими, хто харчувався звичайною дієтою за той самий період часу. Попередні дослідження продемонстрували, що HFD може викликати запалення низької ступеня тяжкості через збільшення рівня ендотоксинів, що виникає внаслідок модуляції мікробіоти кишечника та збільшення проникності кишечника 12, 49. Ендотоксин, отриманий з кишечника (LPS, основний компонент зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій) стимулює клітини запалення, такі як лімфоцити та макрофаги тощо, які згодом виробляють секрецію медіаторів запалення, таких як NO, TNF -α, IL-6. Та CRP 50, 51, 52 .

У цьому дослідженні як URAM, так і FRAM демонстрували протизапальну активність in vitro, що продемонстровано їх здатністю значно послаблювати індуковане ЛПС виробництво NO в клітинах RAW 267,4, не впливаючи на життєздатність клітин. Протизапальна активність URAM та FRAM була додатково підтверджена у нашому дослідженні in vivo, де обидва препарати спричинили значне виснаження рівня сироваткових ендотоксинів, TNF-α та IL-6 у тварин групи HFD + LPS. Однак у згаданих вище дослідженнях FRAM продемонстрував значно вищий інгібітор вироблення NO порівняно з RAM в концентрації 50 мкМ, а вплив тварин групи LPS + HFD на FRAM, але не URAM, призвів до значно нижчого рівня CRP. Критично важливий білок, пов'язаний з бактеріальною інфекцією та запаленням 53. Виходячи з цих висновків, можливо, що ферментована оперативна пам’ять є більш ефективною, ніж неферментована оперативна пам’ять для послаблення системного запалення.

У ссавців було підраховано, що понад 10 трильйонів мікробів колонізують шлунково-кишковий тракт протягом їхнього життя 65, 66. Комменсальні мікроорганізми відіграють важливу роль у сприянні перетравленню їжі та засвоєнню поживних речовин, регулюючи проникність кишечника та запобігаючи утворенню пухлин тощо. через взаємодію з господарем 67, 68, 69. Повідомлялося про взаємозв’язок ожиріння, спричиненого HFD, зі змінами мікробіоти кишечника та запалення кишечника на тваринній моделі із ожирінням, спричиненим дієтою 54. Відповідно до цього попередні дослідження виявили, що дисбаланс у мікробній популяції кишечника сприяє розвитку ожиріння, яке опосередковується за рахунок стимулювання енергетичного накопичення з раціону, індукції системного запалення та прискорення відкладення жиру 70, 71 .

Зокрема, в шлунково-кишковому тракті людини майже вся мікробіота кишечника (приблизно 99%) походить від п’яти типів філ, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria і Proteobacteria 45. Особливий інтерес, зменшення як відносного співвідношення бактероїдетів, так і відношення бактероїдетів до фірмікутетів суттєво пов'язане зі збільшенням маси тіла 45, 69, 72. Крім того, кілька рядків доказів вказують на те, що численні види кишкових бактерій можуть перешкоджати розвитку та початку ожиріння. Наприклад, повідомлялося, що корисний ефект проти ожиріння надавали in vivo різні види Lactobacillus, включаючи Lactobacillus plantarum 73, 74, Lactobacillus gasseri 75, Lactobacillus Casei Shirota 76 та ін. Індукований розподіл жиру 77 та Akkermansia muciniphila показали, що вони зворотне індуковане HFD ожиріння, метаболічну ендотоксемію та покращують гомеостаз глюкози .

На закінчення, лікування ферментованим ADR призвело до більш помітного поліпшення ожиріння, спричиненого HFD, ніж ADR. На основі наших досліджень in vitro та in vivo можна подумати, що антиадипогенний та проти ожиріння вплив FRAM може бути опосередкований, принаймні частково, придушенням адипогенезу різними механізмами, посилюючи засвоєння глюкози, впливаючи на розподіл. мікрофлори кишечника, що супроводжується поліпшенням проникності кишечника та профілактикою ендотоксемії та супутнього запалення. Потрібні подальші поглиблені дослідження для виявлення сполук та медіаторів, присутніх у ферментованому AMR, які можуть враховувати корисні властивості FRAM.

Методи

Культура бактерій

Інокулюм Lactobacillus plantarum був щедрим подарунком від Cell Biotech (Gimpo, Південна Корея). Перш ніж проводити трав'яну ферментацію, бактеріальний запас неодноразово пересівали при 37 ° C протягом 48 годин у відварі Lactobacilli MRS (Difco-BD, Sparks, MD, США) в анаеробних та стерильних умовах.

Приготування та бродіння водного екстракту RAM.

Тварини та експериментальний дизайн.

Аналіз біохімічних показників сироватки крові

Сироватку відокремлювали від крові за допомогою пробірок Vacutainer (BD, Плімут, Великобританія) після згортання при кімнатній температурі протягом 1 години. Рівні загального холестерину (ТК), ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ), тригліцеридів (ТГ) та аспартат-трансамінази (АСТ) визначали за допомогою відповідних комерційних наборів від Asan Pharmaceutical (Сеул, Південна Корея). Рівень ендотоксину в сироватці крові визначали за допомогою набору Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (ENDOSAFE, SC, USA) згідно з нашим попереднім звітом 12 та відповідно до протоколу виробника набору.

Визначення лактулози та манітолу в сечі

Для оцінки пасивної проникності кишечника тваринам, яким вводили лактулозу (L) та маніт (M), рівні цих двох цукрів у сечі вимірювали за допомогою наборів K-Lactul та K-Manol (Megazyme, Wicklow, Ireland) згідно з нашими попередніми звіт 12 та дотримуючись інструкцій виробника набору. Результати були виражені як відношення лактулози до манітолу (L/M).

Визначення сироваткових рівнів прозапальних цитокінів

Рівні С-реактивного білка (CRP), фактора некрозу пухлини-альфа (TNF-α) та інтерлюкіну-6 (IL-6) у сироватці крові вимірювали за допомогою відповідних комерційних наборів ІФА для щурів (USCN, TX, USA для CRP; BioLegend, Сан-Дієго, Каліфорнія, США для TNF-α та IL-6) відповідно до інструкцій виробника набору.

Мікробіологічний аналіз калу з використанням денатураційного градієнтного гель-електрофорезу та кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-ПЛР)

qRT-ПЛР зразків ДНК калу проводили за допомогою приладу LightCycler (Roche Applied Science, штат Індіанаполіс, штат Ізраїль, США) та набору LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green (Roche Applied Science). Праймери (COSMO GENETCH, Сеул, Корея), використовувані для націлювання гена 16S рРНК бактерій, наведені в таблиці S2 48, 80, 81. Оптимізацію температур відпалу праймерів та стандартизацію умов реакцій ампліфікації ПЛР у реальному часі проводили, як описано раніше 22. Для аналізу та інтерпретації даних було використано програмне забезпечення LightCycler (Roche Applied Science). Відносна чисельність бактеріального типу або роду була представлена ​​2 −ΔC, де C t позначає порогове значення перетину, отримане програмним забезпеченням. Остаточні результати виражаються як нормовані значення кратності щодо нормальної групи.

Статистичний аналіз

Усі експериментальні результати виражаються як середнє значення ± SD (стандартне відхилення). Для статистичного аналізу даних було застосовано програмне забезпечення для соціальних наук (SPSS, версія 17.0, Чикаго, Іллінойс, США). Статистичну значимість різниці визначали за допомогою одного способу ANOVA з подальшим тестом на ЛСД (найменш значуща різниця) після спеціального тесту. Різниця вважалася статистично значущою, коли Р