реферат

Некротизуючий ентероколіт (НЕК) є найпоширенішим важким невідкладним станом шлунково-кишкового тракту, що вражає недоношених дітей. Захворювання часто має швидкий початок з кількома наявними симптомами, які можуть бути використані для надійного прогнозування його виникнення. Її швидке настання та прогресування до смерті, а також важка захворюваність, коли дитина виживає, вимагає інструментів ранньої діагностики, які можна використовувати для виявлення тих дітей, які мали б найбільший ризик розвитку хвороби і на яких були б спрямовані ранні профілактичні заходи . Незважаючи на те, що дослідження припускають ефективність декількох методів, таких як водневий дихання, медіатори запалення в крові, сечі чи калі та генетичні маркери, вони мають недоліки, що обмежують їх використання. Застосування нещодавно розроблених "омічних" підходів може забезпечити біомаркери для ранньої діагностики та цілеспрямованої профілактики цієї хвороби.

Головний

Стіл в натуральну величину

Дотепер вивчені техніки

Відбір проб водню.

Геномні маркери.

Ризик розвитку НЕК також був пов'язаний з частотою генотипу інтерлейкіну (ІЛ) -18 607 АА (12). Частота генотипу АА значно вища у немовлят із ІІІ стадією НЕК порівняно з І та ІІ стадіями (17). Таким чином, наявність генотипу АА може негативно вплинути на результат НЕК через змінені рівні IL-18, цитокіну, який індукує інтерферон-γ та посилює вироблення цитокінів типу 1 (Th1) Т-хелперів та накопичення IL-8 (17 ). Також було доведено, що у немовлят з НЛБ з НЕК менше шансів мати мутантний аллель рецептора α-ланцюга IL-4 у порівнянні з дітьми без НЕК (17). Варіант гена рецептора IL-4 пов'язаний із посиленою трансдукцією сигналів IL-4, що зміщує розвиток лімфоцитів до більш вираженого стану Th 2 клітин Th (Th2) (17). Вважається, що збільшена кількість клітин Th2 у носіях цього генетичного поліморфізму є захисним фактором проти розвитку НЕК (17).

Ці результати свідчать про те, що НЕК не опосередковується лише генетикою, а генетичними факторами, пов’язаними з взаємодією хазяїн-бактерія. Таким чином, пошук генетичних маркерів, схоже, має певний потенціал, але чутливості та специфічності прогнозування залишається дуже важко досягти, головним чином завдяки взаємодії з факторами навколишнього середовища, які також відіграють важливу роль у патогенезі НЕК.

Кишкова мікрофлора.

Велика різноманітність бактерій, наявних у немовлят до розвитку НЕК, та супутня нездатність виділити/ідентифікувати відомого збудника свідчать про те, що коменсальні мікроби, як правило, є перехожими, які за певних умов можуть посилювати такі патологічні процеси, як неконтрольоване запалення. Пов’язана гіпотеза полягає в тому, що певний мікробний склад, який може бути нормальним для доношених дітей, може бути винуватцем, що призводить до неадекватного продукуючого НЕК запального каскаду у недоношених дітей, на відміну від наявності певних патогенних видів (7, 8). . Однак існують давніші дані, які показують, що в кишковій флорі можуть спостерігатися специфічні зміни, що передують розвитку НЕК (25). Тому очевидно, що мікробна екологія є фактором розвитку НЕК, але остаточна причинність ще не визначена.

Коли дітей з НЕК порівнювали з контрольними немовлятами без НЕК (що відповідає гестаційному віку при народженні та постменструальному віці), дослідження, засноване на культивуванні потенційних патогенів, не виявило конкретних бактерій, асоційованих із захворюваннями (26). Це спостереження не виключає можливості того, що достатньо керовані дослідження з використанням сучасних методів молекулярного мікробного аналізу можуть ідентифікувати патогени в майбутньому. На додаток до конкретних патогенів, колонізація мікробіозу змінила його різноманітність або появу домінантних коменсальних мікробів, які з’ясовують неадекватну імунну відповідь, яка може бути важливою в процесі захворювання (27). Недавні дослідження з використанням молекулярних методів дали початковий огляд (28). Застосування підходів, заснованих на рибосомній РНК 16S, значно полегшило вивчення мікробної екології тракту ШКТ, оскільки воно обходить потребу в культурі (29). Нові потужні молекулярні підходи, включаючи піросеквенування, тепер дозволяють глибокий аналіз насичення, який може виявити сигнатурні сигнатури для бактерій, які мало сприяють загальному мікробіому (29).

Ці нові методи молекулярної мікробіоти для виявлення мікроорганізмів, що не піддаються культивуванню, пропонують нові можливості для ідентифікації конкретних патогенів, асоційованих з НЕК, а також мікроекологічних особливостей кишечника, які можуть призвести до патогенезу НЕК. Є аргументи проти обґрунтованості мікробіозу калу як сурогату в часі мікробіозу, який знаходиться в тісному контакті зі слизовою оболонкою тонкої та товстої кишок. Недоношені діти іноді мають дефекти, і тому неможливо виявити деформації у складі мікробіонів у ректальних мазках або зразках стільця, коли запалення починається або прогресує на поверхні слизової оболонки кишечника.

Останнім часом з'явився інтерес до зміни мікробіозу кишечника для маніпулювання хворобою. Дослідження антибіотиків (30), пребіотиків (31) та пробіотиків (32, 33) проводили з надією на розробку профілактичної терапії НЕК. Хоча немає переконливих доказів остаточних профілактичних стратегій, багато чого повинно з'явитися у галузі маніпуляцій з мікрофлорою.

Медіатори запалення.

Подібно до синдрому сепсису та респіраторного дистрес-синдрому у дорослих, патогенез НЕК, схоже, включає шлях, який включає ендогенне вироблення медіаторів запалення, що беруть участь у розвитку кишкової травми (34). Вважається, що ендотоксин/ліпополісахарид (LPS), фактор активації тромбоцитів (PAF), фактор некрозу пухлини альфа (TNF-α), IL-8 та інші хемокіни та цитокіни разом з простагландинами, лейкотрієнами та оксидом азоту вважаються включеними в остаточну загальний шлях патогенезу НЕК (1, 34, 35). Сироватки, тканини, стілець або інші зразки з ранніх часових точок розвитку захворювання можуть допомогти виявити ранні запальні події, які схиляють дитину до НЕК, забезпечуючи тим самим можливість втручання. Тут ми коротко оцінимо деякі запальні та інші маркери, які були і/або все ще оцінюються для ранньої діагностики НЕК.

В одному дослідженні концентрації IL-1β, IL-6, ендотоксину/LPS та TNF-α вимірювали на початку клінічного захворювання (35). Встановлено, що ендотоксемія новонароджених та вивільнення прозапальних цитокінів є важливими чинниками поліорганної недостатності та смертності. Ендотоксемія була найважчою на початку захворювання у немовлят із НЕК, що свідчить про те, що недостатність кишкового бар’єру відіграє важливу роль у несприятливих наслідках в НІКУ (35).

В іншому дослідженні оцінено зв'язок між сироватковими С-реактивними білками (СРБ) та НЕК (36). Виявлено, що рівень СРБ є ненормальним як на ІІ стадії, так і на ІІІ стадії НЕК. У немовлят з НЕК постійно підвищений СРБ після початку відповідного медичного лікування припускав розвиток ускладнень НЕК, що часто вимагало хірургічного втручання.

Ймовірно, що відсутність діагностичних та терапевтичних процедур для НЕК зумовлена ​​відсутністю загальної картини захворювання. Правильно вивірені та відкалібровані математичні моделі запалення та його патологічних наслідків у НЕК можуть бути корисними для прогнозування фізіологічної та біологічної відповіді у немовлят, які страждають на цю хворобу, але, як нещодавно припускали, ще не повністю розроблені (44).

Інші посередники.

Низькі концентрації аргініну та глутаміну також пов'язані з НЕК. Добавки кожної з цих амінокислот вважалися стратегією профілактики захворювань (45, 46). Однак ці терапії можуть бути неспецифічними для НЕК, а недоліки, ймовірно, зумовлені низькими доходами та великим споживанням під час стресу (47).

Нарешті, фактори росту оцінювались не лише як діагностичні засоби, а й як терапевтичні заходи. З діагностичною метою було встановлено проспективний аналіз, який показав, що рівні епідермального фактора росту слинних залоз були значно нижчими у недоношених дітей, а більш швидке збільшення епідермального фактора росту слинних залоз у перші тижні життя було пов'язано з більшою частотою NEC (48). В іншому терапевтичному дослідженні оцінювали рівні інсуліноподібного фактора росту-1 (IGF-1) та його вплив на дозрівання функції кишечника у недоношених дітей (49). Вважали, що добавки IGF-1 у передчасні форми прискорюють ріст та розвиток бар’єрних та абсорбційних властивостей кишечника (49), потенційно зменшуючи ймовірність розвитку НЕК. Однак було виявлено, що добавки не є суттєво корисними, ймовірно, через синергію з іншими факторами, які не були доповнені разом з IGF-1 (49). Однак ці важливі спостереження свідчать про те, що біомаркери можна розробляти для раннього виявлення НЕК та підтримувати подальші дослідження.

Нові технології біомаркерів

Нещодавно з’явилися нові молекулярні методи для їх використання для розробки біомаркерів для таких захворювань, як рак передміхурової залози (50), захворювання печінки (51), зараження навколоплідними водами (52) та виявлення ретинопатії недоношених дітей (53). Ще більш перспективним є висновок про те, що протеомічні відбитки пальців виявилися більш точними, ніж звичайне фарбування за Грамом та посів у діагностиці інтраамніотичної інфекції (54). Такі успіхи з використанням молекулярних методів дають надію на пошук біомаркера для виявлення та, можливо, запобігання НЕК.

Протеоміка.

Протеоміка - наука, що швидко розвивається, яка зосереджується на ряді завдань, покладених на білки (54, 55). Це стосується структури, функцій та взаємодії білків, включаючи їх ідентифікацію та кількісну оцінку (55). Він також включає вивчення впливу їх взаємодії на біологічні функції. У немовлят з ШНЛ, чутливих до НЕК, ймовірно, що внаслідок передчасних пологів розвиваються білки дисгармонізовані і що або сигнальні шляхи між мікробіозом та кишковим бар'єром, або перенесення світлової маси через кишковий бар'єр змінюються таким чином, що сприяє до NEC (56).

Протеомічні технології передбачають кілька етапів. Поліакриламідні та двовимірні методи гелевого (2D гелевого) електрофорезу поділу білків використовують білкову властивість, яка за наявності електричного поля надає їм внутрішній заряд білків, характерну електрофоретичну рухливість, що дозволяє їх відокремлювати та ідентифікувати на основі на їх молекулярну молекулярну структуру. вага та чистий заряд (57). З цих двох методів метод 2D-гелю вважається кращим варіантом для профілювання білків з низькою роздільною здатністю та високою роздільною здатністю при пошуку біомаркерів для NEC (58).

Ще однією потужною методикою в області діагностичних біомаркерів та ідентифікації білків, які беруть участь у захворюваннях, є мас-спектрометрія (59). Ця техніка передбачає введення енергії, достатньої для цільової молекули, щоб вона іонізувалась і розпадалася. Потім отримані фрагменти аналізують на основі співвідношення маса/заряд. Доступні різні типи методів мас-спектрометрії, включаючи лазерну десорбцію/часову спектрометрію, лазерну десорбцію/час іонізації, мас-спектрометрію та тандемну мас-спектроскопію (MS/MS). (57, 59). Двовимірний гель часто використовують разом з мас-спектрометрією (55, 57). Одним із таких прикладів є виявлення потенційних біомаркерів, характерних для передчасного розриву оболонок у передчасних пологів (54). Малюнок 1 ілюструє, як ці методи можна застосовувати у дітей людини.

біомаркери

Процес виявлення біомаркерів.

Повнорозмірне зображення

Транскриптоміка.

Транскриптоміка - це глобальний спосіб оцінки моделей експресії генів (60). Він включає вивчення всіх молекул мРНК або транскриптів та оцінку змін у ініціюванні, переробці та деградації білка. Техніка полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на основі транскриптоміки обіцяє найближчим часом виявити біомаркери в дослідженнях NEC. ПЛР вже використовується для ідентифікації раніше не культивованих організмів (21, 29, 61). Відбір проб, придатних для ПЛР, є привабливим, оскільки необхідні всі необхідні кількості, оскільки вони додатково посилюються під час цього процесу (60, 61). Зразки можна отримати практично з будь-якої тканини, наприклад шкіри, слини та щічних подряпин, без зайвих інтенсивних інвазивних досліджень або забору крові.

Однак ці нові методи не позбавлені проблем. Однією з найбільш очевидних є необхідність у відповідному обладнанні. Для ефективного застосування цих методів має бути доступне точне та доступне обладнання. Якщо виявлено, що раніше невідомий ген диференційовано виражається у порівнянні зі здоров’ям, залишається важливим, щоб відповідний генний продукт підтверджувався як фенотипово, так і на рівні білка. Хоча ця технологія доступна для проведення такого типу оцінки, вузьке місце у розробці хорошої діагностичної платформи випливає із проблем визначення статистичної значущості та біологічної значимості диференційованого транскрибованого гена.

висновок

Факти свідчать, що основний патофізіологічний внесок у розвиток НЕК пов'язаний з помилковою взаємодією між кишковими мікробами та реакцією господаря на ці мікроби. Нову інформацію, швидше за все, надаватимуть нещодавно розроблені технології, підтримані такими ініціативами, як проект людського мікробіома. Методи "Омік" для виявлення біомаркерів у зразках тканин, отриманих неінвазивно, виявляються особливо привабливими для розробки нових діагностичних маркерів для догляду за плямами та привабливими для розробки ефективних методів лікування, таких як харчові добавки (фактори росту, пребіотики, тощо). ), бактеріальні маніпуляції (пробіотики, антибіотики) або навіть безпосередня терапія продуктами рекомбінантних генів для зменшення або усунення запальної реакції.

глосарій

кишковий білок, що зв'язує жирні кислоти