субодиниці

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • LMP7-дефіцитні миші стійкі до HFD-індукованого ожиріння
  • Миші з дефіцитом LMP7 стійкі до індукованих HFD метаболічних розладів
  • Дефіцит LMP7 не впливає на споживання їжі, рухову активність та енергетичні витрати.
  • Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів
  • LMP7 у клітинах кісткового та некісткового мозку сприяє розвитку ожиріння.
  • Дефіцит LMP7 послаблює запальні реакції в жировій тканині.
  • Обговорення
  • Методи
  • Тварини
  • Мікро-КТ аналіз
  • Біохімічний тест
  • GTT та ITT
  • Гістологія та імуногістохімія.
  • RT-PCR-аналіз у реальному часі
  • Експерименти з БМТ
  • Дихальні гази та руховий аналіз
  • Збір калу та екстракція ліпідного калу
  • Аналіз проточної цитометрії
  • Експерименти в пробірці
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Коментарі

Предмети

  • Ендокринна система та метаболічні захворювання.
  • Метаболічний синдром
  • Ожиріння

Резюме

Вступ

Ожиріння є основним фактором ризику інсулінорезистентності, гіперглікемії, дисліпідемії та гіпертонії, відомих як метаболічний синдром, і стало глобальною проблемою охорони здоров'я. Ці порушення обміну речовин збільшують ризик серцево-судинних захворювань та цукрового діабету 2 типу та сприяють збільшенню смертності та захворюваності. Хоча патогенез ожиріння складний і включає кілька факторів, останні дослідження показали, що запалення жирової тканини є ключовим патогенним фактором 1, 2. Насправді макрофагальна інфільтрація жирової тканини спостерігається на тваринних моделях ожиріння, а також у людей із ожирінням із метаболічним синдромом. Ці клітини є основним джерелом для продукування запальних цитокінів/хемокінів, включаючи фактор некрозу пухлини α (TNF-α), інтерлейкін (IL) -1β та мотив CC мотивований ліганд 2 (CCL2, також відомий як хемоаттрактант білка моноцитів 1 [ MCP-1]), який, у свою чергу, завербує запальні клітини та надалі сприяє запаленню жирової тканини. Однак те, як запалення виникає та регулюється в патофізіології ожиріння, до кінця не вивчене.

Результати

LMP7-дефіцитні миші стійкі до HFD-індукованого ожиріння

Спочатку ми дослідили, чи може дефіцит LMP7 вплинути на розвиток ожиріння, використовуючи мишей дикого типу (WT) та LMP7 -/-, яких годували нормальною їжею або HFD протягом 8 тижнів. Хоча не спостерігалося суттєвої різниці у збільшенні маси тіла між мишами WT та LMP7 -/- на звичайному харчуванні, миші LMP7 -/- набирали значно менше маси тіла, ніж миші WT на дієті з високим вмістом дієти. Жир (HFD) (рис. 1А). Маса епідидимальної та підшкірної білої жирової тканини (WAT) різко зменшилася у мишей LMP7 -/- порівняно з мишами WT (рис. 1B). Відносна вага (маса тканини/маса тіла) кожного WAT у мишей LMP7 -/- була нижчою, ніж у мишей WT (рис. 1C, печінка: зниження на 15,9%, епідидима: 44,7%, брижа: 24,9%, периренально: 50,7 % та підшкірно: 47,3%). Зниження було гістологічно пов’язано зі зменшенням розміру адипоцитів у епідидимальній та підшкірній ВАТ (рис. 1D, E). Аналіз комп’ютерної томографії (КТ) показав меншу масу вісцерального та підшкірного жиру у мишей LMP7 -/-, ніж у мишей WT (рис. 1F, G). Ці результати вказують на те, що дефіцит LMP7 захищає від ожиріння, спричиненого ВЧЧ.

( А - С ) Рівні TCHO, TG ( ДО ), Глюкоза в крові ( B ) та сироватковий інсулін ( C. ) у сироватці крові у WT та LMP7 -/- мишей у нормальній їжі та HFD (n = 8–12). ( ОФ ) Результати GTT ( D ) та ITT ( І ) у WT та LMP7 -/- мишей у звичайному харчуванні та HFD (n = 8 для кожного). Дані виражаються як середнє значення ± SEM. * p -/- у нормальній їжі або HFD (рис. 3А), ми вимірювали рухову активність та витрати енергії в обох штамах, щоб оцінити різницю в базальних показниках метаболізму. Суттєвих відмінностей у руховій активності, споживанні кисню (VO 2), коефіцієнті дихального обміну (RER), споживанні вуглеводів (CH) та жирі (FAT) між WT та LMP7 -/мишами не було. годування HFD. (Рис. 3B, C). Підтверджуючи цей результат, хоча експресія Ucp1 (роз’єднуючий білок 1 або термогенін) була збільшена в жировій тканині коричневого жиру шляхом годування HFD, не було значущих відмінностей у його експресії між мишами WT та LMP7 -/- (дані не наведені).

( ДО ) Споживання їжі в мишах із WT та LMP7 -/- у звичайній їжі (n = 7–8) та HFD (n = 13–14). ( B ) Рухова активність у мишей WT та LMP7 -/- при нормальному годуванні та HFD (n = 8 для кожного). ( C. ) Дані про витрати енергії. VO 2, RER, CH та FAT у мишей WT та LMP7 -/- у звичайному харчуванні та HFD (n = 8 для кожного). Дані виражаються як середнє значення ± SEM.

Повнорозмірне зображення

Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів

Обговорення

Основними висновками цього дослідження є наступні: (1) дефіцит LMP7 зменшив накопичення жиру, спричиненого HFD, і захистив від ожиріння; (2) Дефіцит LMP7 покращив непереносимість глюкози та чутливість до інсуліну, а також покращив метаболізм ліпідів та глюкози (3) не було різниці у споживанні їжі, руховій активності та енергетичних витратах між мишами WT та LMP7 -/-; (4) Дефіцит LMP7 зменшує всмоктування ліпідів; (5) Експерименти BMT показали, що LMP7 у клітинах, отриманих з кісткового мозку, а не з кісткового мозку, сприяв розвитку ожиріння, спричиненого HFD; (6) Дефіцит ЛМП зменшував запальні реакції, такі як інфільтрація макрофагів та експресія хемокінів, одночасно збільшуючи продукцію адипонекції. Результати цього дослідження дозволяють припустити, що LMP7 сприяє запальним реакціям макрофагів у жировій тканині та розвитку ожиріння та метаболічних розладів. Наскільки нам відомо, це дослідження дає перші докази того, що LMP7 відіграє важливу роль у розвитку ожиріння та порушення обміну речовин.

Все більше доказів вказує на те, що запалення відіграє важливу роль у розвитку ожиріння та порушення обміну речовин 1, 2. Хоча існує ряд повідомлень, що описують роль запалення в його процесі, до кінця не зрозуміло, як відбувається запалення та регулюється. Хоча, як відомо, імунопротеасома відіграє важливу роль у презентації антигенів класу МНС класу I, останні дослідження показали, що LMP7 необхідний для продукування прозапальних цитокінів, таких як TNF-α та IL-6, та для прогресування експериментального артриту та коліті 5, 6. У цьому дослідженні ми демонструємо, що дефіцит LMP7 інгібує запалення жирової тканини, ожиріння та метаболічні порушення: це свідчить про те, що інгібування LMP7 має потенціал для профілактики та лікування ожиріння та метаболічних розладів. Насправді кілька експериментальних досліджень повідомили, що селективний інгібітор LMP7 ONX-0914 є значно ефективним при лікуванні експериментального артриту та коліту 5, 6. Отже, вплив цього інгібітора LMP7 на ожиріння та порушення обміну речовин ще слід вивчити у майбутніх дослідженнях.

Ми демонструємо, що дефіцит LMP7 знижував експресію підшлункової ліпази, збільшував вміст ліпідів у калі та пригнічував підвищення рівня ТГ у плазмі крові після перорального прийому олії або годування HFD. З іншого боку, рівень глюкози та інсуліну в сироватці крові не впливав на мишей LMP7 -/- на нормальному харчуванні. Непереносимість глюкози та чутливість до інсуліну покращились у мишей LMP7 -/-. Отже, LMP7 впливає на внутрішню та зовнішню секреторну функцію підшлункової залози та бере участь у травному та гормональному гомеостазі, що має важливе значення в метаболічному стані мишей.

На закінчення ми чітко показуємо, що дефіцит LMP7 пригнічує макрофагове запалення в жировій тканині та посилює розвиток ожиріння та метаболічних розладів у мишей, що харчуються HFD. На основі наших висновків ми припускаємо, що дефіцит LMP7 пригнічує запалення жирової тканини, пригнічуючи індукцію прозапальних цитокінів у макрофагах та адипонекцію, що виробляється адипоцитами. Крім того, LMP7 впливає на зовнішню та внутрішню секреторну функцію підшлункової залози. Це дослідження не тільки демонструє, що LMP7 може бути потенційною терапевтичною мішенню для профілактики та лікування ожиріння та метаболічних розладів, але також дає нові уявлення про механізм, що лежить в основі патофізіології цих розладів.

Методи

Тварини

Всі експерименти на тваринах були схвалені Експериментальним комітетом по догляду та використанню тварин Керівництва медичного університету Джичі для лабораторних тварин і проводились відповідно до керівних принципів Медичного університету Джічі. Мишей C57BL/6J WT було придбано у Japan SLC, Inc. (Хамамацу, Японія). Миші LMP7 -/- раніше були описані 4. Самців мишей (9-10 тижнів) годували 60 ккал% HFD (дослідницькі дієти: D12492, Японія LSG, Токіо) або звичайною їжею (CE-2; CLEA Japan Inc., Осака). Кожну мишу зважували кожні 2 тижні. У кінцевих точках мишей голодували протягом 6 год, повторно зважували і збирали кров для отримання сироватки. Після перфузії тканини ретельно вирізали і зважували.

Мікро-КТ аналіз

Мікро-КТ-аналіз проводили за допомогою LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Токіо, Японія). М’язову, вісцеральну та підшкірну жирову масу аналізували за допомогою програмного забезпечення LaTheta (Hitachi Aloka Medical).

Біохімічний тест

Кров відбирали з хвостової вени 6 голодуючих мишей. Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою глюкометра Terumo MEDISAFE ™ (Terumo Co., Токіо, Японія). Рівні TCHO і TG у сироватці крові або плазмі крові вимірювали за допомогою системи FUJI DRI-CHEM (Fujifilm, Токіо, Японія). Рівні інсуліну, адипонектину та лептину в сироватці крові вимірювали за допомогою наборів ІФА (Sibayagi, Gunma, Японія; R&D Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота; та BioVendor R&D, Брно, Чеська Республіка).

GTT та ITT

GTT проводили у мишей на стандартному або HFD-їжі протягом 8 тижнів. Мишей заздалегідь голодували 6 годин, маючи вільний доступ до води. Потім глюкозу в крові вимірювали безпосередньо перед внутрішньочеревною ін’єкцією глюкози (1 г/кг маси тіла у фізіологічному розчині), а потім через 15, 30, 60, 90 та 120 хвилин після введення. ITT проводили аналогічно, вводячи ін’єкцію інсуліну (0,75 ОД/кг маси тіла) замість глюкози.

Гістологія та імуногістохімія.

Фарбування ВІН та імуногістохімія для F4/80 та LMP7 проводили, як описано раніше 4, 23 .

RT-PCR-аналіз у реальному часі

Загальну РНК готували з нирки з використанням ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Тояма, Японія) відповідно до інструкцій виробника. RT-ПЛР-аналіз у реальному часі проводили за допомогою системи виявлення кісток PCR Thermal Cycler Takara TP960 (Takara Bio Inc, Шига, Японія) для виявлення експресії мРНК, як описано раніше 23. Експресія генів нормалізувалася за допомогою експресії Actb (β-актину) за допомогою програмного забезпечення, що постачається разом із системою. Праймери, що використовуються для аналізу RT-PCR, перелічені в додатковій таблиці S1.

Експерименти з БМТ

Мишей BMT генерували, як описано раніше 24. Щоб перевірити відновлення кісткового мозку після трансплантації, використовуючи цей протокол, ми використовували мишей із зеленим флуоресцентним білком (GFP) як донорів. Аналіз проточної цитометрії показав, що через 8 тижнів після ВМТ клітини периферичної крові складали понад 90% GFP 24 позитивних клітин. За допомогою цього протоколу ми створили 3 типи мишей BMT: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- миші).

Дихальні гази та руховий аналіз

Мишей індивідуально утримували в метаболічній камері протягом 48 годин, щоб дозволити їм адаптуватися до навколишнього середовища та досягти постійного коефіцієнта дихального обміну (RER). Аналіз дихальних газів (O 2 і CO 2) проводили за допомогою системи аналізу метаболічних газів з відкритим контуром, підключеної безпосередньо до мас-спектрометра (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Японія). Споживання кисню (VO 2) та вироблення діоксиду вуглецю (VCO 2) вимірювали кожні 5 хвилин для кожної клітки (одна миша). RER розраховували як співвідношення VCO 2/VO 2. Загальне споживання вуглеводів (CH) та споживання жиру (FAT) розраховувались за допомогою стехіометричних рівнянь Фрейна, як показано нижче: CH = 4,51 × VCO 2 - 3,18 × VO 2 [мг/хв] і FAT = 1,67 × (VO 2 - VCO 2) [мг/хв]. Рухову активність визначали кожні 5 хвилин для кожної камери (одна миша) за кількістю інфрачервоних променів, порушених в обох напрямках X та Y, використовуючи систему контролю активності (ACTIMO-100; Shinfactory, Фукуока, Японія) у поєднанні з метаболічними камерами.

Збір калу та екстракція ліпідного калу

Фекалії мишей, що харчуються HFD, розміщувались індивідуально протягом 24 годин, збирали та сушили вакуумним центрифугуванням. Висушений кал зважували і подрібнювали в ступці. Розмелений кал переносили в скляну трубку і повторно зважували. Ліпіди екстрагували із застосуванням хлороформу: метанолу (2: 1) двічі за методом Фолча і зважували. Вміст ліпідів розраховували як% від ваги меленого калу.

Аналіз проточної цитометрії

Інфільтруючі лейкоцити в епідидимальній ВАТ аналізували за допомогою проточної цитометрії, як описано раніше 11. Дані про проточну цитометрію отримували за допомогою FACSVerse (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія) та аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA). Реагенти, що використовуються для аналізу проточної цитометрії, перелічені в додатковій таблиці S2.

Експерименти in vitro

Перитонеальні макрофаги миші культивували в RPMI1640 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) та 1% антибіотиком - антимікотиком (Invitrogen, Carlsbad, CA) з використанням 24-лункових планшетів. Через 48 год клітини стимулювали 400 мкМ пальмітату (10% BSA) 26 протягом 24 год. Рівні IL-1β, IL-6 та TNF-α у супернатантах визначали за допомогою наборів ELISA (R&D Systems Inc.).

статистичний аналіз

Результати з нормальним розподілом аналізували параметричним неспареним t -тестом. Результати без нормального розподілу аналізували за допомогою критерію Манна - Уітні, критерію Крускала - Уолліса або поздовжнього аналізу. Всі аналізи проводились із використанням програмного забезпечення Stata, випуск 13 (Stata Corp., College Station, TX). P -значення