Предмети
Резюме
Вступ
На додаток до своєї суттєвої ролі як будівельного матеріалу для синтезу білка та росту тварин, метіонін виявився ключовим фактором у контролі окисного стану 7, 8. Насправді залишки метіоніну в білках легко реагують з різноманітними активними формами кисню (АФК), утворюючи сульфоксид метіоніну (MetO), а редуктази MetO каталізують залежність від тіоредоксину відновлення MetO до метіоніну in vivo. Отже, це циклічне взаємоперетворення залишків метіоніну білка між окисленою та відновленою формами може розглядатися як ефективний механізм видалення АФК 9, 10. Крім того, метіонін живить шлях транссульфуризації, який веде до синтезу інших амінокислот сірки, зокрема цистеїну 11, 12. Цистеїн необхідний для синтезу глутатіону (GSH) та таурину, двох компонентів, які мають здатність впливати на клітинний окисно-відновний стан і, отже, є важливими для захисту господаря від окисного стресу 13, 14, 15, 16 . Таким чином, метіонін відіграє ключову роль у захисті від окисного стресу.
Це дослідження було проведено з метою з'ясування впливу дієтичного дефіциту метіоніну на контроль рівня окиснення печінки та виявлення основних механізмів у райдужної форелі (Oncorhynchus mykiss).
Матеріали і методи
Експерименти проводились відповідно до законодавчої бази Франції та ЄС. Вони поважають директиву 2010/63/ЄС про захист тварин, що використовуються в наукових цілях, а також указ № 2013-118 від 1 лютого 2013 року французького законодавства, що регулює етичне поводження з тваринами. Протокол був схвалений Французьким національним консультативним комітетом з питань етики під посиланням APAFIS8222-2017041016141425-v4.
Випробування на годівлю та розведення.
Повний розмір таблиці
Індивідуальну масу тіла, добовий темп приросту, добове споживання корму та ефективність корму розраховували, як описано вище 24 .
Наприкінці 6-тижневого випробування годування кров і печінку відбирали з 3 риб на бак, знеболювали бензокаїном (30 мг/л) і забивали сильним ударом в голову. Зразки крові відбирали через 16 год після останнього прийому їжі з хвостової вени в гепаринізовані шприци та центрифугували (3000 г, 5 хв); Вилучену плазму негайно заморожували і витримували при -20 ° C. Печінку збирали через 2 год, 4 год і 16 год після останнього прийому їжі, розтинали, зважували і негайно заморожували в рідкому азоті і витримували при -80 ° С.
Хімічний склад дієт.
СД, сирий жир та вміст сирої енергії у дієтах визначали, дотримуючись описаних вище процедур 24. Вміст сирого білка вимірювали як N × 6,25 методом Кельдаля після перетравлення кислоти (ISO 937: 1978) та за допомогою аналізатора Leco FP-2000 (Leco Corp., St. Joseph, MI). Вміст крохмалю вимірювали ферментативним методом (InVivo Labs). Концентрації амінокислот у раціоні визначали за допомогою вологої хімії в лабораторії Evonik-Degussa (Ханау, Німеччина) методом іонообмінної хроматографії з дериватизацією після колонки нінгідрином. Амінокислоти окислювали перформатичною кислотою, яку нейтралізували метабісульфітом натрію 25; Директива Комісії 1998). Амінокислоти вивільняли з білка гідролізом 6н. HCl протягом 24 годин при 110 ° C і кількісно визначали за допомогою методу внутрішнього стандарту, вимірюючи поглинання продуктів реакції з нінгідрином при 570 нм.
Рівень метіоніну в плазмі.
Концентрацію вільного метіоніну в плазмі крові визначали за допомогою іонообмінної хроматографії з використанням аналізатора амінокислот Biochrom 20, літієвої колонки та літієвих буферів 26, 27 .
Вестерн-блот-аналіз
Печінку, відібрану через 2 та 16 год після останнього прийому їжі, гомогенізували та аналізували згідно з протоколом 24, деталізованим вище, та використовуючи такі антитіла: антифосфорофосомний білок S6 кіназа 1 (P-RPS6K1, Thr389, # 9205, Cell Signaling Technology); анти-RPS6K1 (# 9202, технологія стільникової сигналізації); фосфо-EIF4EBP1, білок 4E 1, що зв’язує фактор ініціювання еукаріотичного трансляції (P-EIF4EBP1, Thr37/Thr46, # 9459, Cell Signaling Technology); анти-EIF4EBP1 (# 9452, технологія стільникової сигналізації); антифосфо eIF2α (Ser51, # 9721, технологія стільникової сигналізації); антикарбоксильний кінець eIF2α (# 9722, технологія клітинної сигналізації); антифосфо-AMP-активована протеїнкіназа (P-AMPK, Thr172, # 2532, Cell Signaling Technology); анти-AMPK (# 2532, технологія стільникової сигналізації); анти-β-тубулін (TUBB) (# 2146, Технологія клітинної сигналізації); анти-LC3B (# 2775, технологія стільникової сигналізації). Всі ці антитіла вже перевірені у райдужній форелі 24, 28 .
Для оцінки рівнів білків, пов'язаних з мітохондріями (TIMM23, мітофузин2, PARKIN, фосфо-убіквітин (Ser65) та загальний убіквітин), тканини гомогенізували ультразвуковим перериванням у 9 об. Холодного буфера, що містить 50 мМ Tris (рН 7,4). 5 мМ EDTA, 1,4-дитиотрейтол 2 мМ та коктейль з інгібітором протеази (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі; P-2714). Потім гомогенат центрифугували і супернатант негайно використовували для Вестерн-блот-аналізу, як описано вище, і використовуючи відповідні антитіла: анти-TIMM23 (# 611222, BD Transduction LaboratoriesTM), анти-мітофузин2 (Mfn2) (# ab56889, abcam), анти -PARKIN (# ab15954, abcam), антифосфо-убіквітин (Ser65) (Ser65, # ABS1513-I, EMD Millipore) та анти-загальний убиквітин (# MAB1510, EMD Millipore). Перед використанням кожного антитіла, амінокислотну послідовність цільового білка контролювали в базі даних SIGENAE (//www.sigenae.org), щоб перевірити збереження послідовності антигену з відповідною послідовністю ссавців, забезпечуючи хорошу специфічність антитіло до ссавців, що використовується при аналізі зразків.
Ферментативна діяльність
Печінку, зібрану через 16 год після їжі, гомогенізували гончарем при 4 ° С у буфері, що містив 0,1 М триетаноламіну, рН 7,3, а потім гомогенат використовували для ферментативних аналізів. Концентрацію білка вимірювали за методом Лоурі.
Активність каталази оцінювали за допомогою оксиграфа Oroboros. За каталазною активністю гомогенізованих тканин реєстрували вироблення кисню у присутності 0,01% H2O2 та 1 мкМ антиміцину, щоб уникнути перешкоджання споживання кисню мітохондріями. Всі ферментативні активності виражаються у відсотках від контрольного стану, крім каталази, яка виражалася як потік O 2 пмоль/с * мл * мг.
Кількісний RT-PCR аналіз
Кількісний аналіз RT-PCR проводили в печінці риб, відібраних через 2 та 16 год після останнього прийому їжі. Умови протоколу для підготовки зразків та кількісної RT-PCR були раніше опубліковані 28, 29. Праймери, що використовуються для аналізів RT-PCR у реальному часі, перелічені в таблиці 2. Праймери рецептора активатора проліфератора пероксисоми-γ-коактиватор-1а були перероблені за допомогою програмного забезпечення Primer3. Для аналізу експресії відносну кількісну оцінку експресії гена-мішені проводили за допомогою методу ΔCT, описаного в 30. Значення відносної експресії генів коефіцієнта подовження еукаріотичного трансляції 1 α 1 (eef1a1) використовувалося для нормалізації виміряних значень експресії цільової мРНК, і було встановлено, що вона істотно не змінюється з часом відбору проб або між дієтичними процедурами (дані не наведені).
Повний розмір таблиці
Визначення окисного стану.
Концентрації білків карбонілів та глутатіону вимірювали у зразках печінки риб через 16 год після останнього прийому їжі (N = 6/дієта). Зразки готували та аналізували на білкові карбоніліни згідно з протоколом виробника (Millipore; Oxyblot Protein Oksidation Detection Kit S 7150). Кількісну оцінку білка проводили за допомогою програми Odyssey, яка виражала співвідношення білків, отриманих до DNPH/β-тубуліну (TUBB) з печінки.
Оксидований глутатіон (GSSG) та відновлений глутатіон (GSH) вимірювали в гомогенатах печінки риб за допомогою набору для аналізу глутатіону Cayman (Bertin Pharma) відповідно до інструкцій виробника.
Визначення мітохондріальної ДНК.
Виділення ДНК проводили у зразках печінки риб через 16 год після останнього прийому їжі (N = 6/дієта), дотримуючись процедур, описаних раніше у Liu et al. 31. Кількість копій mtDNA визначали кількісною ПЛР. Ряд генів виявляли, як описано вище у розділі кількісної RT-PCR. номер копії mtDNA (мітохондріальна кодована лейцинова тРНК 1 UUA/G: прямий праймер: AAAACAGACAAGGGGGCCA, зворотний праймер: AGGGTGAGGAAAGCAACTGC) був нормалізований до гетамічної ДНК бета-2-макроглобуліну в зразку (вперед праймер: TCATCAGGCTCCCTCGGTGCTC, TCTCGGTGCCCCAT TCATCGCTACCATAGGTG Праймери для генів MT-TL1 та beta 2 M були перероблені за допомогою програмного забезпечення Primer3, а отримані амплікони очищені та послідовно розподілені (Beckman-Coulter Genomics, Takeley, Великобританія).
Електронний мікроскоп
Для електронної мікроскопії свіжі блоки печінки, відібрані через 4 год після останнього прийому їжі (1 мм 3) (N = 3/дієта), аналізували за допомогою 2,5% глутаральдегіду в 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,4) і згодом встановлювали 1%. Тетроксид осмію у фосфатному буфері. Умови як ультратонких зрізів, так і спостереження були вже описані в Seiliez et al. 28 .
Статистичний аналіз
Дані виражаються як середні значення ± SEM. Нормальність оцінювали за допомогою тесту Шапріо, тоді як рівність дисперсій визначали за допомогою тесту Левена. Коли дотримувались нормальність та/або рівні дисперсії даних, для оцінки t-критерію Стьюдента порівнювали дані між дієтою CTL, що годується рибою, та дієтою MD, що годується рибою. На відміну від цього, коли дані не відповідали припущенням про рівність нормальності та/або дисперсії, для порівняння даних з обох груп використовували тест Вілкоксона. Статистичний аналіз рівнів мРНК генів Asns та ddit3 проводили за допомогою двосторонньої ANOVA. Статистичний аналіз проводили з використанням програмного забезпечення R. Для всіх статистичних аналізів рівень значущості був встановлений у P 
Дефіцит метіоніну не впливає на рівень захисної антиоксидантної мРНК ( ДО ) супероксиддисмутаза 1 (sod1), ( B ) супероксиддисмутаза 2 (sod2), ( C. ) глутатіон-S-трансфераза π (gstπ) та ( D ) глутатіондісульфідредуктазу (gsr) вимірювали за допомогою кількісних аналізів RT-qPCR у реальному часі у контролі печінки форелі (CTL) або дієти з дефіцитом метіоніну (MD), і проби відбирали через 16 годин після останнього прийому їжі. Значення експресії нормалізували за допомогою мРНК фактора подовження еукаріотичного трансляції 1 α 1 (eef1a1). Каталазна активність ( І ) вимірювали оксиграфом через 16 год після останнього прийому їжі. Значення є середніми (n = 6), із стандартною похибкою середнього значення, представленого вертикальними смугами. * використовували для позначення суттєвої різниці між лікуванням між двома дієтичними групами (P
На закінчення отримані результати показали, що годування райдужної форелі раціоном з дефіцитом метіоніну протягом 6 тижнів призводить до падіння врожаю, пов’язаного як із загальним дефектом мітохондрій, так і зі зниженням окисного стану в печінці. Отримані результати також виявили значне збільшення мітофагії за цих умов та підкреслили участь осі PINK1/PARKIN у цій події. Наскільки нам відомо, раніше мало чи нічого не було спрямовано на харчову регуляцію мітофагії, і відповідні механізми все ще далекі від розуміння і варто дослідити. З практичної точки зору аквакультури ми демонструємо, що доступність метіоніну в раціоні має важливе значення для цілісності мітохондрій і може бути способом розуміння зниження приросту риби, яка годується МД. Надалі іншою важливою темою буде розуміння того, як дефіцит метіоніну впливає на цілісність мітохондрій.
Висловлення подяки
Автори відзначають інституційні фонди EVONIK Industries та INRA для фінансування цього дослідження, а також Національне агентство з досліджень і технологій (ANRT; Франція) за грант СС (грант на наукові дослідження CIFRE). Особлива подяка всім членам Club d'Autophagie Bordelais (CAB) за корисні обговорення та пропозиції, Карін Діас, В. Верону, А. Суржету та А. Герману (INRA St Pée-sur-Nivelle) за їх техніка допомоги та технічний персонал рибного господарства (Ф. Валле, Ф. Тер'єр, А. Лануке, Ф. Сандрес).