МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ
А. БІОЛОГІЧНИЙ МАТЕРІАЛ
Використовували самців щурів Sprague Dowley, розділених на 2 групи та 4 підгрупи в кожній із середньою вагою на групу від 194 до 202 г на початку експерименту.
Б. ДІЄТИ
Підготовлених дієт було чотири для кожної групи (всього 8) і називались:
I група: група, котра ковбасу проковтнула і була поділена на:
IDC: Контрольна дієта (дієта 10 мг Vit. E/K)
IDCE: Контрольна дієта з віт. Е (257 мг віт. Е/К дієта)
ВПО: проблема дієти (20% хот-догів у раціоні)
ІДПЕ: Проблема дієти з віт. Е (257 мг віт. Е/К дієта)
ІІ група: групу, якій вводили нітрит (5 мг/добу у формі нітриту натрію), розділили на:
IIDC: Контрольна дієта (дієта 10 мг Vit. E/K)
IIDCE: Контрольна дієта з віт. Е (257 мг віт. Е/К дієта)
IIDP: Контрольна дієта з нітритом (5 мг нітриту/день)
IIDPE: Контрольна дієта з віт. Е та нітритом (5 мг нітриту на добу)
Вони отримували їжу та воду ad libitum. Склад кожної з дієт наведено в таблиці складу дієт.
Склад дієти***
*Замість казеїну використовували знежирене молоко.
**Крім вітаміну Е
***Дієта IDCE та IDPE також містила 257 мг вітаміну Е/К дієти,
****Підгрупа IIDP споживала дієту IDC плюс 5 мг нітриту натрію/день (приблизно 11 мг/K/день)
Підгрупа IIPE споживала дієту IDCE плюс 5 мг нітриту натрію/день (приблизно 11 мг/K/день)
Підгрупа IIDC споживала дієту IDC
Підгрупа IIDCE споживала дієту IDCE
C. РЕАГЕНТИ:
Всі реагенти були аналітичного класу. Карбонат натрію, бікарбонат натрію, соляна кислота, фосфат натрію, фосфат натрію та перекис водню були придбані у Е. Мерка. Адреналін, EDTA, BSA, до н. тіобарбітурат, CDBN та GSH були отримані від Sigma Chemical Co. Вітамін Е був переданий Швейцарською хімією.
Щурів поміщали індивідуально в металеві клітини в світлому та провітрюваному середовищі. Їм було дано дванадцять годин світла і дванадцять годин темряви та кімнатну температуру 26 ± 1 градус С. Лікування проводилося протягом 12 тижнів (короткостроково) [15].
Через 12 тижнів тварин жертвували декапітацією, а печінку негайно виймали, поміщали в крижану ванну, а потім частину печінки очищали, зважували та відокремлювали (1,5 г) від більшої частки. Яку промивали середовище для гомогенізації для видалення крові (три рази). Гомогенат 10% мас./Об. Готували у скляному гомогенізаторі типу Поттер-Ельвехем із тефлоновим плунжером. Середовище для гомогенізації містило 50 ммоль/л фосфатного натрію, буфер рН 7,0.
Гомогенат центрифугували при 750 г X 10 хв для видалення неушкоджених клітин, ядер та залишків клітинної мембрани. Друге центрифугування надосадової рідини при 9800 г X 15 хв для усунення мітохондрій і третє центрифугування з отриманням "цитозолю", супернатант від другого центрифугування проводили при 22000 г X 100 хв. Всі центрифугування проводили в центрифузі RC2-B типу Sorvall, ротор SS34 при температурі від 0 до 5 градусів за Цельсієм.
1. Вимірювання ліпопероксидації:
Його проводили за методикою Бюге та Авста [5] з деякими модифікаціями, вимірюючи вироблення малонового диальдегіду, який при реакції з ТБК утворює кольоровий комплекс, який зчитується при 535 нм.
Процедура була такою: 0,5 мл гомогенату плюс 1,0 мл 20% TCA, приймати киплячу водяну баню протягом 10 хв, охолоджувати і додавати 1,5 мл 0,67% TBA 0,25 HCl N, окріп знову приймати у ванну протягом 30 хв. . Охолодити в крижаній воді та центрифугувати при 4000 об/хв протягом 10 хв, видалити супернатант і прочитати.
Для розрахунків використовували коефіцієнт молярної екстинкції 1,56 X 10 5 ммоль -1 см -1 кольорового комплексу, утвореного малоновим диальдегідом-тіобарбітуратом.
2. Діяльність СОД:
Був використаний метод Місри та Фрідовича [37], модифікований Сан і Зігманом [47], який базується на здатності СОД інгібувати аутоксидацію адреналіну до адренохрому.
Реакційна кювета містила 2,94 мл 0,05 моль/л карбонатного буфера, рН 10,2, 1 X 10 -4 моль/л EDTA і 10 мкл цитозолю. Реакцію починають додаванням 50 мкл адреналіну 5,5 мг/мл. Зчитування при 320 нм.
Розрахунки проводились на основі даних, отриманих з лінійної частини кінетики реакції.
Одиниця СОД визначається як кількість ферменту, який пригнічує самоокислення 50% загального адреналіну, присутнього в реакції.
3. Активність глутатіон трансферази:
Це було здійснено технікою Хабіга та ін. [28].
Основою реакції є здатність GSH кон'югувати з CDNB. Збільшення поглинання при 340 нм протягом 1 хв прямо пропорційно активності присутнього ферменту.
У 1 мл тест-камери помістіть 940 мкл буфера, що містить 0,1 моль/л фосфатного буфера, рН 6,5 і 3,3 мг GSH, додай 40 мкл етанольного розчину CDNB при 0, 5065 г%, інкубуй при 25 градусах за Цельсієм. 5 хв і реакцію починають додаванням 20 мкл цитозолю.
Для розрахунків використовується молярний коефіцієнт коефіцієнта CDNB 9,6 мМ -1 м -1 .
4. Визначення білків:
Білки гомогенату та цитозолю виготовляли за методикою Лоурі [34].
Спектрофотометричні вимірювання виконувались на моделі Gilford 240, на самописувальному пристрої також Gilford моделі 6051 та на спектрі моделі LKB Ultrospec II, підключеному до комп'ютера Apple.