личинок

  • Предмети
  • Резюме
  • Вступ
  • Результати
  • Харчова дієта впливає на розвиток комарів, їх фізіологію та вседозволеність Плазмодій
  • Харчова дієта впливає на мікробіоти личинок і дорослих комарів
  • Обговорення
  • Методи
  • Заява з етики
  • Колонія комарів та утримання
  • Підживлення личинок
  • Вимірювання довжини личинки
  • Вимірювання довжини крила
  • Аналіз мікробіоти та експресії генів
  • Інфекції Плазмодій
  • Статистика
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткові рисунки та таблиця 1
  • Коментарі

Предмети

  • Інфекційні захворювання
  • Мікробіом
  • Немодельні організми

Резюме

Вступ

В даний час приблизно половина світового населення перебуває під загрозою зараження малярією, спричиненою зараженням найпростішими паразитами плазмодію 1. Малярія людини передається через укуси інфікованих самок комарів Anopheles. Anopheles gambiae та A. coluzzii є основними переносниками малярії Plasmodium falciparum в Африці, де у 2015 р. 88% випадків смерті від малярії сталося 1. При попаданні в організм самок комарів під час зараження інфекційною кров’яною їжею паразити плазмодію статево розмножуються в просвіті середньої кишки, потім проходять перитрофічну мембрану та епітелій середньої кишки та диференціюються в ооцисти, досягнувши базальної пластинки 2. У найближчі один-два тижні ооцисти піддаються внутрішньому мітотичному поділу та дозріванню, поки не розриваються, вивільняючи тисячі паразитів, які мігрують до слинних залоз і можуть бути передані людському господареві укусом комара.

Стадія ооцисти є критичним вузьким місцем у розвитку паразитів, визначаючи, чи комар вб’є паразита чи передасть малярію. Успіх паразитарної інфекції залежить від генетичних та генетичних особливостей кожного комара. По-перше, розмір комара впливає на об’єм поглинаної крові, отже, на кількість поглинених паразитів 3. Крім того, шлях імунодефіциту NF-KB (Imd) та шлях тіоестер-білок 1 (TEP1) доповнюють паразитів, коли вони перетинають епітелій та контактують із системою кровообігу, відповідно 2, 4, 5 6. Нарешті, бактеріальна спільнота середньої кишки комара різко розмножується протягом 24 годин після прийому крові і негативно впливає на розвиток плазмодію, викликаючи імунні реакції та синтезуючи активні форми кисню 6, 7, 8, 9. Склад мікробіоти також може впливати і/або контролюватися плазмодієм, як передбачає позитивна кореляція між часткою ентеробактерій та успішним зараженням плазмодієм 10 .

У лабораторному контексті ми припускаємо, що такі наслідки живлення личинок та навколишнього середовища можуть призвести до умов вирощування, а точніше - до личинки, що впливає на біологію личинок та дорослих комарів. Оскільки, як відомо, дієта впливає на склад мікробіоти в метазоанах 23, 24, нас особливо цікавило оцінити, чи впливає вона на мікробіоти колонізованих комарів і, отже, потенційно сприяє великій різниці в складі мікробіоти між лабораторіями 10, 25, 26, 27. У цьому дослідженні ми аналізуємо вплив личиночного раціону на розвиток, мікробіоти та конкуренцію вектора А. coluzzii. Зосередившись на трьох рибних дієтах, які зазвичай використовуються в комах, ми показуємо, що ці дієти по-різному впливають на швидкість розвитку личинок, розмір дорослих комарів, а також на личинку та дорослу мікробіоту. Дієта личинок також суттєво впливає на поширеність та інтенсивність зараження P. berghei, ймовірно, із залежним від мікробіоти механізмом.

Результати

Харчова дієта впливає на розвиток комарів, фізіологію та вседозволеність плазмодія

( до ) Довжина личинок на 7 день годівлі однією з трьох дієт личинок: рибні пластівці тетраміну (FF), гранули басейну доктора Кларка (D) або рибні гранули Nishikoi (FP). ( b ) Середній час окукливания личинок, передбачений кожною дієтою з першого дня годування. ( c ) Довжина дорослих крил після годівлі личинок у трьох лічинових режимах. Дані показують середнє значення ± сім з 3 незалежних експериментів, а статистичний аналіз є ANOVA після коригування попередньої моделі. *** стор

Повнорозмірне зображення

Харчова дієта впливає на мікробіоти личинок і дорослих комарів

На закінчення наші результати дають нові уявлення про вплив лічинової дієти на розвиток комарів, мікробіоти та дозвільність до паразитів малярії. Вони також представляють технічний інтерес для вирощування комарів, демонструючи, що швидшого розвитку можна досягти при використанні гранульованих дієт D і FP і що FP виробляє комарів з більшим рівнем зараження плазмодієм .

Методи

Заява з етики

Використання тварин здійснювалось відповідно до Закону Великобританії про тварини (про наукові процедури) 1986 р. Протокол зараження комарів P. berghei шляхом годування кров’ю заражених паразитами мишей здійснювався відповідно до ліцензії Міністерства внутрішніх справ Великобританії PPL70/7185. Січень 2010 р. Процедури відрізняються легким та середнім ступенем тяжкості, а кількість тварин, що використовуються, мінімізується шляхом включення найбільш економічних протоколів. Протоколи були впроваджені після схвалення Комітетом з розгляду етики Імператорського коледжу.

Колонія комарів та утримання

Експериментальна робота була проведена в колонії Ан. Колуцці Нгуссо, створеній у 2006 р. З комарів, зібраних у полі Камеруну, утримуваних у крові людини при 27 ° C та вологості 70% із світловим циклом/темрявою 12 год: 12 год. Дорослих комарів годували 5% розчином фруктози, а личинок утримували в дистильованій воді. Покоління личинок до тих, що були отримані для дієтичного лікування, годували Tetra FF подрібненими до фрагментів 1–2 мм, контрольну дієту, використовувану в цьому дослідженні. Лялечок збирали щодня, поміщали в скляні склянки з дистильованою водою і переносили в клітини.

Підживлення личинок

Для кожної дієтичної обробки 400 (± 10%) 48-годинного віку без годівлі А. Личинок coluzzii першої інстанції підраховували вручну або за допомогою сортувальника личинок COPAS (Union Biometrica, США) і поміщали у пластиковий лоток. Кожен піднос для личинок годували однією з трьох звичайних дієт на основі риби: рибні пластівці Tetra Tetramin ('FF'), гранули басейну доктора Кларка ('D') та рибні гранули Nishikoi ('FP'). Зведення харчових продуктів цих дієт наведені в таблиці 2. Як повідомляється в таблиці 2, дієти постачались у кількості, яка забезпечує порівнянний рівень харчових складових у кожній їжі. FFs злегка перемішували, щоб зменшити розмір пластівців, як це зазвичай роблять у нашій лабораторії для вирощування личинок.

Повний розмір таблиці

Вимірювання довжини личинки

Дев'ятиденних личинок (з часу збору яєць) збирали під час кожної обробки в рамках 3 незалежних експериментів і поміщали в окремі лунки 96-лункової пластини для візуалізації при 20-кратному збільшенні. Загальну довжину тіла вимірювали від верхівки голови до кінчика живота за допомогою Фіджі 41 .

Вимірювання довжини крила

Двадцять дорослих з кожного лікування були зібрані з 4 незалежних експериментів. З кожної особини виймали одне крило і склеювали на аркуші паперу. Після сканування паперу довжини крил вимірювали за допомогою Фіджі 41 .

Аналіз мікробіоти та експресії генів

Двадцять особин (9-денних личинок, самки за 3-5 днів до або через 24 години після годування кров'ю) відбирали з кожної обробки з 4 незалежних експериментів, суспендували в 70% -ному етанолі протягом 3-5 хвилин, потім промивали 3 рази в PBS як і раніше 25. У дорослих кишечник та яєчники розтинали та відбирали проби у 2 групах із 10 тканин. Щипці та предметні стекла очищали дистильованою водою та етанолом між кожним зразком. Для кількісної оцінки бактерій у їжі добову кількість (d7 +) їжі гомогенізували в 5 мл стерильної води, потім відбирали зразки 1 мл, центрифугували при 800 g протягом 5 хвилин і супернатант відкидали. Для кожної дієти контролювали 4 повторення. Для нормалізації кількості РНК суспензію клітин Sf9 із злитої культури колби площею 175 см2 розділили на 12 зразків.

РНК екстрагували з цілих личинок, дорослих тканин та вміст гранульованої води тризолом та хлороформом, осаджували ізопропанолом та двічі промивали 70% етанолом. Зворотну транскрипцію (Takara) проводили за допомогою PrimeScript RT Enzyme Mix I з 650 нг РНК, дотримуючись інструкцій виробника. Бактеріальний ген 16S рРНК використовували для кількісного визначення за допомогою qRT-PCR, проведеного на LightCycler 480 (Roche), використовуючи набір SYBR Premix Ex Taq (Takara), дотримуючись інструкцій виробника. Бактеріальне навантаження та склад оцінювали, використовуючи загальні праймери генів 16S рРНК для всіх бактерій та специфічні для сімейств бактерій, які, як відомо, колонізують комарів у комах, відповідно (Таблиця S1 та посилання 25). Бактеріальне навантаження та експресія вітеллогеніну представлені як співвідношення цільового гена до рибосомного білка гена 40S Anopheles еталонного S7 (S7), тоді як бактеріальне навантаження в їжі визначали як співвідношення GAPDH (гліцеральдегід-3 -фосфатдегідрогеназа) ген збереження в клітинах Sf9.

Плазмодієві інфекції

Жіночій миші CD1 віком 8-12 тижнів вводили внутрішньочеревно 100 мкл крові, зараженої P. berghei 5O7, і утримували протягом двох днів, щоб забезпечити ріст паразитів та диференціювання гаметоцитів. Перевіривши, що паразитемія становить від 3 до 8%, миші вводили внутрішньом’язово 4 мкл. г -1 розчину анестетика (Rompun 0,33%, кетамін 33 мг мл -1 у PBS) і використовували для годування трьома склянками комарів з кров’ю на зміну 5-10 хв. Комарів витримували протягом 12 днів при 20 ° C, щоб забезпечити розвиток паразита до стадії ооцисти. Потім загиблих комарів видаляли та оцінювали, а всіх комарів, що вижили, розтинали для визначення кількості ооцист за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Для кожного експерименту щонайменше 50 комарам на кожну умову пропонували кров’яне борошно, а незасвоєних комарів вбивали через 24 години. В середньому за кожен експеримент підраховували ооцисти 36 (± 3,6 сем) комарів. Різниця середньої інтенсивності та поширеності згадується в тексті як середнє значення ефекту кожної репліки; тобто (дані (контрольна дієта) - дані (контрольна дієта))/дані (контрольна дієта).

Статистика

Статистичний аналіз проводили із використанням узагальнених лінійних змішаних моделей (GLMM) у R (версія 3.2.3). Було проведено тест ANOVA X 2 в логістичній регресії (glmer) з факторіальними даними (поширеність, виживання). Тест Wald Z проводили на нульовій завищеній негативній біноміальній регресії (glmmADMB) для кількості ооцист. Було проведено тест ANOVA X 2 у загальній лінійній регресії (lmer) щодо даних qPCR (16S, експресія гена), довжини личинки, часу окукливания та довжини крила. Аналіз GLMM розкладає дані на фіксований компонент (тут дієти личинок) і випадковий компонент (тут вони повторюють експерименти). Коефіцієнти шансів, представлені на рис. 2, є експоненціальними коефіцієнтами регресії. Розмір вибірки обирали за стандартними протоколами (кількість ооцист, експресія генів, аналіз мікробіоти) або оцінювали відповідно до досвіду вирощування комарів (розвиток личинок). Комарів виключали, якщо вони не харчувалися кров’ю, якщо вони розривалися під час дисекції (аналіз мікробіоти, експресія генів) або якщо вони загинули (як личинки або дорослі особини) під час експерименту.

Додаткова інформація

Коди доступу: Номери приєднання до векторної бази (www.vectorbase.org) генів, згаданих у цьому дослідженні: AgS7 - AGAP010592; Вітеллогенін - AGAP004203.

Як цитувати цю статтю: Linenberg, I. et al. Харчова дієта впливає на розвиток комарів і на вседозволеність плазмодієвої інфекції. Науковий співробітник. 6, 38230; doi: 10.1038/srep38230 (2016).

Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог на опублікованих картах та приналежності до інституцій.

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткові рисунки та таблиця 1

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватись наших Умов та правил спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.