Резюме

Ця стаття описує генерацію та метаболічну характеристику мишей, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру, як модель індукованої дієтою резистентності до інсуліну та ожиріння. Він також має докладні протоколи для проведення перорального тесту на толерантність до глюкози та тесту на толерантність до інсуліну, моніторингу всього організму, змін метаболізму глюкози in vivo.

дослідження

Анотація

Вступ

У розвинених країнах ожиріння та діабет досягли епідемічних масштабів через фізичну неактивність та надмірне споживання оброблених харчових продуктів, наслідки яких - швидка урбанізація, індустріалізація та глобалізація. Незважаючи на те, що дослідження інсулінорезистентності та її супутніх захворювань, таких як гіперліпідемія та атеросклероз, набувають великого значення в останні десятиліття, складні біологічні механізми, що регулюють метаболізм у стані здоров'я та захворювань, залишаються до кінця не вивченими, і все ще існує нагальна потреба в нових способах лікування, що дозволяють запобігти та лікувати ці захворювання 1 .

Інсулін та його протирегуляторні гормони глюкагон служать головними регуляторами клітинного енергопостачання та балансу макроелементів, підтримуючи таким чином адекватну системну концентрацію глюкози в крові 2. Сама глюкоза виступає одним з основних стимуляторів секреції інсуліну β-клітинами підшлункової залози, тоді як інші макроелементи, гуморальні фактори, такі як нервовий вхід, додатково модифікують цю реакцію. Отже, інсулін запускає анаболічні процеси годування, сприяючи дифузії надлишку глюкози в крові в м’язові та жирові клітини, а також активізуючи гліколіз, а також синтез білка або жирних кислот відповідно. Крім того, інсулін пригнічує вихід глюкози в печінці, пригнічуючи глюконеогенез. Хронічне надлишкове споживання енергії та мета-запалення призводять до гіперінсулінемії та периферичної резистентності до інсуліну внаслідок зниження регуляції експресії рецепторів інсуліну, а також змін у подальших сигнальних шляхах, що призводить до порушення чутливості до опосередкованого інсуліном утилізації глюкози, а також недостатнього інгібування вироблення печінкової глюкози 3, 4, 5, 6 .

Широкий вибір тваринних моделей із генетичною, харчовою або експериментальною індукцією захворювання виявився чудовим інструментом для вивчення молекулярних механізмів інсулінорезистентності та різних форм діабету, а також супутніх захворювань 7. Прикладом може служити широко використовувана та добре зарекомендована модель миші, індукована ВЧР, яка характеризується швидким збільшенням ваги за рахунок збільшення споживання їжі в поєднанні з меншою ефективністю метаболізму, що призводить до резистентності до інсуліну 8, 9. Як на моделях на тваринах, так і на людях, підвищення рівня глюкози та інсуліну в крові натще, а також порушення толерантності до введення глюкози використовуються як показники інсулінорезистентності та інших системних порушень метаболізму глюкози. Моніторинг рівня глюкози та інсуліну в крові на початковому або постстимульному рівні - це легкодоступні показники.

Загалом, ми пропонуємо простий протокол для генерування HFD-індукованої моделі миші, одночасно описуючи два потужні підходи до вивчення метаболічних розладів у всьому тілі, США та ITT, які можуть бути корисними інструментами для вивчення патогенезу хвороби та розробка нових методів лікування, особливо у галузі захворювань, пов’язаних із метаболізмом, таких як резистентність до інсуліну та діабет.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі методи, описані тут, були схвалені Віденським медичним університетом щодо догляду за тваринами та проводились відповідно до Федерації європейських лабораторних наукових асоціацій тварин (персонал). Зверніть увагу, що всі процедури, описані в цьому протоколі, повинні виконуватися лише після схвалення установи та уряду, а також персоналом, який є технічно компетентним.

1. Миші, що харчуються HFD

Примітка: Тримайте всіх мишей C57BL/6J на 12-годинному циклі світло/темно з вільним доступом до їжі та води.

  1. У віці 6 тижнів миші поміщають на 8-12 тижнів HFD (40-60% калорій з жиру), щоб викликати ожиріння, одночасно годуючи худу контрольну групу нежирною дієтою (LFD) (10% калорій з жиру).
  2. Щотижня визначайте масу тіла мишей. Криві ваги повинні показувати подібні закономірності в обох групах, з більшим нахилом у групі, що харчується HFD.

Примітка: Якщо під час ОГТТ кожні 15 хв обрані точки часу забору крові, експеримент слід проводити паралельно з максимум 15 мишами, щоб мати принаймні 1 хвилину часу обробки на миші.

Примітка: Ті самі запобіжні заходи, описані для ОГТТ (поводження з мишами, кров’ю, глюкометром та використання вазеліну), також слід застосовувати при проведенні ІТТ. Наприклад, усі ін'єкції слід проводити протягом 15 хв з інтервалом у 1 хвилину, якщо паралельно тестують 15 мишей. Для ІТТ подальший збір зразків крові за допомогою капілярних трубок є необов’язковим.

10 хв у мишей 13, остаточні відмінності після введення інсуліну (наприклад, через 2 год) не можуть відображати прямий ефект дії інсуліну. Адмініструйте 20% розчин глюкози у випадку гіпоглікемічної миші (рівень нижче 35 мг/дл глюкози в крові) і є загроза смерті.

  • Після останніх часових точок розмістіть мишей у домашніх клітках, приготованих з великою кількістю їжі та води.

    • Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Фігура 1 показує графік метаболічного фенотипування мишей на дієті. У віці приблизно 6 тижнів мишей слід помістити в HFD, тоді як група LFD може служити контрольною групою. Важливо, що вага тіла повинна визначатися щотижня, щоб перевірити, чи очікується збільшення маси тіла. Будь-який тип стресу (наприклад, шум або агресивна поведінка самця) може перешкоджати набору маси тіла і повинен бути негайно усунутий. Кожна когорта мишей для дієтичних експериментів повинна складатися щонайменше з 10 мишей, оскільки ці дієтичні експерименти повільні та часто цвітуть (наприклад, миші, що не набирають вагу, або миші з ненормальним рівнем глюкози або інсуліну). Після обраного періоду часу (залежно від гіпотези дослідження та строків очікуваних змін) можна проводити ОГТТ та ІТТ для оцінки дії інсуліну та толерантності до глюкози. У цій роботі були обрані кінцеві моменти для метаболічного тесту.

    Важливо, що між ОГТТ та ІТТ повинен бути час відновлення щонайменше 1 тиждень, оскільки ці експерименти призводять до значної крововтрати і тому є дуже стресовими для мишей. Якщо обсяги забору крові зменшуються (наприклад, якщо спочатку проводиться ІТТ без додаткового забору крові), цей період відновлення також може бути скорочений або пропущений відповідно до рекомендацій щодо багаторазового забору крові у тварин 14, 15, 16, 17 .

    У цьому великому дослідженні, в якому взяли участь загалом 60 мишей C57BL/6J, половина мишей була зафіксована у HFD або LFD у віці 6 тижнів (група n = 30), а збільшення маси тіла контролювали протягом 16 тижнів на дієті. Споживання HFD призвело до значного збільшення маси тіла, як показано на малюнку 4. У віці 6 тижнів маса тіла становила 20,2 г в обох групах. У той час як миші на ЛФД демонстрували постійну, дещо зростаючу масу тіла (31,2 г ± 2,7) протягом спостережуваного періоду, миші на ХФД швидко збільшували свою масу тіла, особливо протягом перших кількох тижнів, а потім досягли своєї максимальної маси тіла. 16 тижнів по тому дієта. Хоча криві ваги демонстрували подібний характер під час експерименту, миші групи HFD досягли в 1,5-2 рази більшої маси тіла (44,4 ± 4,0 г) порівняно з мишами, що годували LFD.

    Щоб дослідити метаболічний фенотип двох когорт, вони виконали ОГТТ (рис.5) та ITT (рисунок 6). Оскільки об’єм крові обмежений у дрібних гризунів, для контролю рівня глюкози в крові під час експериментів із метаболічним фенотипуванням застосовували аналіз точки догляду (POC) для людей з діабетом (глюкометр). Як показано на малюнку 2, Монітори глюкози в крові прості у використанні, вам потрібна лише невелика крапля крові і для документації відображається рівень глюкози в крові протягом декількох секунд. Малюнок 5 представлений часовий курс абсолютного інсуліну та абсолютної глюкози (рис. 5а-b) (рисунок 5 c) рівні під час ОГТТ. Як правило, у здорової миші з нормальною толерантністю до глюкози спостерігається характерне швидке підвищення рівня глюкози в крові, що досягає свого піку через 15-30 хв після глюкози.

    Подальше засвоєння глюкози, здійснюване переважно м’язовою, жировою тканиною та тканинами печінки, призводить до поступового зниження концентрації глюкози в крові. У всіх експериментах миші, яких годували ЛФД, служили контрольною групою, толерантною до глюкози, і тому відповідали очікуваному метаболічному профілю: піку рівня глюкози в крові

    240 мг/дл було досягнуто приблизно через 15 хвилин після введення глюкози, відразу після чого зниження досягло вихідних рівнів приблизно через 60 хвилин після глюкози, що свідчить про адекватний кліренс глюкози. На відміну від цього, HFD-миші досягали приблизно

    320 мг/дл глюкози і майже не виявляв розподілу глюкози, що вказує на стійкість до глюкози. Коли рівні глюкози в крові між цими двома групами вже відрізняються за станом голодування (як у цьому прикладі), для підтвердження результатів необхідно виконати обчислення площі під кривою (AUC) щодо базальної глюкози (Рисунок 5а- b).

    Крім того, рівень інсуліну в циркулюючій крові визначали за допомогою інсулінового аналізу ELISA (рис. 5c), щоб надати більше інформації про основну патофізіологію в цій моделі. Хоча рівні інсуліну майже не змінювались у контрольній групі, миші, яким годували HFD, продемонстрували 16-кратне підвищення в порівнянні з контрольною групою, а також значно підвищену відповідь інсуліну, що вказує на індуковану HFD гіперінсулінемію. знижена здатність елімінації глюкози, що може бути спричинено резистентністю до інсуліну. Однак пам’ятайте, що не слід занадто інтерпретувати результати ОГТТ, цей тест безпосередньо не оцінює дію інсуліну і не повинен використовуватися для висновків щодо резистентності до інсуліну.

    Для вимірювання чутливості до інсуліну у мишей, що годували HFD, ІТТ проводили через 1 тиждень після ОГТТ (рис. 6а). У цьому тесті ступінь зниження концентрації глюкози в крові після введення інсуліну представляє ефективність дії інсуліну на весь організм. Миші, що годувались HFD, демонстрували погіршення зниження рівня глюкози в крові порівняно з контрольною групою, яка годувалась LFD, у всі часові точки на ІТТ, що свідчить про резистентність до інсуліну. Як правило, результати ІТТ представлені як часовий хід рівнів глюкози, але також і зворотно, що AUC нижче базальної глюкози може відображатися, як показано на малюнку 6b. Якщо групи, які порівнюються, мають рівні рівні глюкози в крові натще (що не є випадком у цьому експерименті), рівні глюкози під час ІТТ можуть бути представлені як відсоток базальної глюкози. Як і у мишей, протирегуляторна реакція на інсулін активується, якщо рівень глюкози в крові падає нижче

    80 мг/дл 18: дефекти цієї протирегуляторної реакції на конкретній моделі миші можуть бути неправильно витлумачені як підвищення чутливості до інсуліну. Під час HFD і наступних метаболічних фенотипічних експериментів відслонення може відбуватися часто. Мишей, які не набирають вагу при ВЧС, або тих, хто має ненормальний рівень глюкози або інсуліну натще, слід виключити з аналізу. Для останніх двох можна провести тест на ізоляти для кожної експериментальної групи окремо (наприклад, тест Груббса)

    У цьому дослідженні, як приклад, ми продемонстрували інтерпретацію даних метаболічних експериментів in vivo, проведених на мишах із ожирінням, спричиненим дієтою, непереносимістю глюкози та резистентністю до інсуліну та порівняно з контрольною групою з нормальною масою тіла. Як і слід було очікувати, спостерігалися порушення толерантності до глюкози та гіперінсулінемії у мишей, стійких до інсулінорезистентного ожиріння, порівняно з контрольними мишами, які відповідали віку; Це було виявлено за допомогою добре встановлених та надійних, своєчасних та бюджетних методів, які порівняно прості у виконанні. Відмінності в толерантності до глюкози, рівня інсуліну, а також чутливості до інсуліну, які всі отримують сучасними методами OGTT та ITT, часто можуть допомогти спланувати наступні кроки дослідження, які можуть включати більш складні експерименти, такі як гіперглікемічні або гіперінсулінемічні затискачі, а також експерименти з ізольованими острівцями підшлункової залози.


    Рисунок 1. Схема розкладу для запропонованого режиму дієти та метаболічних експериментів in vivo. Для дослідження метаболічних ефектів HFD у мишей тварин у експериментальній групі поміщають у HFD приблизно у віці 6 тижнів, тоді як контрольна група отримує LFD. Масу тіла мишей слід визначати щотижня, щоб оцінити адекватний приріст ваги. Приблизно через 12 тижнів дієти (або вибраний момент часу, залежно від гіпотези дослідження), метаболічний фенотип мишей оцінюють за допомогою OGTT, після чого 1 тиждень часу відновлення і згодом ITT. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


    Рисунок 2. Методи забору крові під час метаболічних експериментів. Для використання, а також для ІТТ, де потрібне повторне взяття крові, рекомендується брати кров, обережно відрізаючи шматочок 1-2 мм від кінчика хвоста гострими ножицями (варіант А) з подальшим визначенням рівень глюкози в крові за допомогою глюкометра та підвищений збір крові з капіляром для визначення рівня інсуліну та інших відповідних значень крові. Крім того, кров також може бути взята через хвостову вену (варіант В) або шляхом артеріальної катетеризації (не показано). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


    Рисунок 3. Пероральний зонд глюкози (а) та інтраперитонеальна ін'єкція інсуліну (б). Репрезентативні зображення перорального введення глюкози за допомогою голки під час ОГТТ (a) та внутрішньочеревна ін’єкція інсуліну під час ІТТ (b). Детальний опис див. У протоколі. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


    Рисунок 4. Збільшення ваги мишей C57BL/6J, які годували організм HFD та LFD. Миші C57BL/6J лікуватимуть або 60% HFD, або 10% LFD, щоб служити контролем, протягом 20 тижнів. Хоча миші, що годувались HFD, демонстрували очікуване збільшення маси тіла, особливо в перші кілька тижнів дієти, миші, що годувались LFD, демонстрували майже постійну масу тіла протягом спостеріганого періоду. Результати є середнім значенням ± SEM. * p Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Описані тут підходи OGTT та ITT часто можуть пояснити спостережувані відмінності в толерантності до глюкози і можуть надалі слугувати припущенням про те, що пізніше будуть проводитись більш складні експерименти наступним чином (наприклад, гіперглікемічні затискачі або дослідження на ізольованих острівцях). Підсумовуючи, ми представляємо простий протокол для генерації HFD-індукованої моделі миші та далі описуємо OGTT та ITT, які є потужними інструментами для оцінки змін метаболічного фенотипу in vivo і можуть бути корисними для вивчення механізмів метаболічні захворювання, а також нові терапевтичні підходи.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.