Резюме
ЦІЛЬ: Дослідити інгібуючу дію CT-II, екстракту Nomame Herba, на активність ліпази in vitro та на ожиріння у щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру in vivo .
КОНСТРУКЦІЯ: Аналіз на інгібуючий вплив CT-II на активність ліпази проводили шляхом вимірювання вільних жирних кислот, що виділяються після інкубації середовища з CT-II, ліпазою панкреатичної свині та триолеїном (експеримент 1). У експериментах in vivo нежирних або ожирілих щурів (570–718 г) годували високожирною дієтою, що містить 60% жиру, з або без CT-II протягом 8 тижнів (експеримент 2), протягом 14 днів (експеримент 3) або протягом 12 тижнів (експеримент 4) відповідно.
ВИМІРЮВАННЯ: часовий хід маси тіла, споживання їжі, маси органів (параметричний жир, печінка, серце та нирки) та параметри плазми (тригліцериди, загальний холестерин, глюкоза, АСТ, АЛТ та інсулін), загальна кількість жиру та загального холестерину виміряний. Також проводились гістологічні дослідження печінки.
Результати: CT-II пригнічував активність свинячої ліпази залежно від дози in vitro (експеримент 1). Вага тіла та печінки була зменшена, а гістологічне дослідження печінки показало поліпшення жирності печінки у тварин, які отримували КТ II (експеримент 2). CT-II суттєво пригнічував збільшення маси тіла та підвищення рівня тригліцеридів у плазмі крові залежно від дози, не впливаючи на споживання їжі у нежирних щурів, які харчувались жирною дієтою. Підвищений рівень AST і ALT у плазмі крові також зменшився (експеримент 3). Коли ожирілих щурів, які харчувались жирною дієтою, лікували CT-II протягом 6 місяців, спочатку зменшували масу тіла, а згодом набір ваги значно усували. Загальний жир у тілі також був значно зменшений, і спостерігали значне зниження рівня АСТ та АЛТ у плазмі крові (експеримент 4).
ВИСНОВКИ: Ці результати продемонстрували, що інгібітор ліпази CT-II ефективний у профілактиці та поліпшенні ожиріння, жирової печінки та гіпертригліцеридемії у щурів, які харчуються з високим вмістом жиру.
Доступ надано
Вступ
Ліпаза підшлункової залози є найважливішим ферментом для перетравлення тригліцеридів у раціоні. 1 Застосування інгібітора ліпази раніше обговорювалось як лікування ожиріння. Орлістат (Ro 18-0647), гідрогенізоване похідне ліпстатину, отримане з Streptomyces toxitricini, є потужним інгібітором шлункової, підшлункової та карбоксилестер-ліпази 2, і було доведено, що він ефективний для лікування ожиріння людини. 3, 4, 5 Існування інгібіторів ліпази досліджено в різних харчових продуктах, і наявність цих інгібіторів повідомляється у зернових культурах, у пшеничних висівках та зародках пшениці 6 та в сої 7, 8. Інгібітори ліпази також шукали в натуральних продуктах, таких як китайські ліки та різні трави. 9
Бобова рослина, Cassia mimosoides L. var. номаме Макіно (Nomame Herba), вирощується в Японії та Китаї і традиційно вживається як чай в Японії. Під час вибору інгібіторів ліпази серед натуральних продуктів екстракт Nomame Herba продемонстрував неабияку інгібуючу дію на ліпазу. У цьому дослідженні вивчали інгібуючу дію цього екстракту, CT-II, на активність ліпази in vitro та ефекти проти ожиріння у щурів, які отримували дієту з високим вмістом жиру in vivo. .
Методи
Підготовка КТ-II
CT-II являв собою фракцію водного етанолового екстракту з Nomame Herba, що містив переважно проантоціанідин (конденсований танін). Приготування фракції здійснювали таким чином: 800 г надземної частини сухої рослини екстрагували 10 л 50% етанолу (4 л, 3 л, 3 л, три екстракції). Екстракт піддавали колонці Diaion HP 20 (Mitsubishi Chemical Corporation), промивали 30% етанолом і елюювали 80% етанолом. Елюйований розчин упарюють і ліофілізують насухо, потім отримують 24 г порошку CT-II. Порошок CT-II використовували як суміш з експериментальною дієтою in vivo. .
Інгібіторний ефект in vitro CT-II на активність ліпази
Аналіз активності ліпази з використанням тригліцеридів в якості субстрату проводили за методом Fukumoto et al. 10 Таким чином, інгібуючу дію (pH 7, 4) та 1 мл 50% розчину CT-II тетрагідрофурану (THF) змішували у пробірці типу L (φ18 × 120 мм) та 1 мл свинячого розчину підшлункової Потім додавали ліпазу (Sigma типу II, 0,71 мг/мл у вигляді білка в буфері McIlvaine) та інкубували при 37 ° С протягом 15 хвилин при струшуванні. Реакцію зупиняли додаванням етанолу, а виділені жирні кислоти титрували 0,05 М NaOH. Заготовку вимірювали за допомогою 50% ТГФ без CT-II (експеримент 1).
Вплив CT-II in vivo на масу тіла, жир і метаболіти
Тварини та дієта.
У дослідженні були використані самки щурів Sprague-Dawley. Вони були розміщені в окремих клітках з нержавіючої сталі при контрольованій температурі (24 ± 2 ° C) і протягом 12 годин циклу світло/темно з вільним доступом до води та порошкоподібною дієтою з високим вмістом жиру, що містить 60% жиру, 7,5% вуглеводів, 24,5% білка (6,7 ккал/г), як і в попередньому дослідженні. 11 Звичайна дієта, що містить переважно знежирене соєве борошно та рибне борошно, називається екструдованою дієтою (CE-2, Clea Japan Inc.).
Процедури.
CT-II спочатку виявляв інгібуючу активність ліпази в дослідженні in vitro. Оскільки надмірне споживання дієтичного жиру сприяє розвитку ожиріння, профілактичний вплив екстракту на розвиток ожиріння вивчали у щурів, які отримували дієту з високим вмістом жиру. Після адаптації до дієти з високим вмістом жиру та лабораторних умов протягом 1 тижня нежирних щурів масою 239-251 г розділили на дві групи. Контрольній групі давали лише жирну дієту; Інша група отримувала дієту з високим вмістом жиру із змішаним CT-II у концентрації 2,5%. Вага тіла вимірюється щотижня. Після 8 тижнів лікування CT-II тварин забивали, вимірювали вагу органів та гістологічно досліджували органи (експеримент 2).
Потім досліджували вплив дози CT-II на масу тіла та метаболіти плазми у щурів. Худих щурів масою 265–298 г розділили на шість груп. Контрольна група отримувала лише дієту з високим вмістом жиру, як у експерименті 2. Інші п’ять груп отримували дієту з високим вмістом жиру із змішаним вмістом CT-II у концентраціях 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,5% та 3,5%, відповідно. Вагу тіла вимірювали через 4, 7, 11 та 14 днів після початку лікування CT-II, а щоденне споживання їжі вимірювали протягом 2-тижневого періоду лікування. Згодом кров взяли з яремної вени після 12-годинного голодування. Зразки центрифугували, плазму відокремлювали і заморожували до аналізу. Тригліцериди плазми (TG), загальний холестерин (TC), глюкоза, аспартатамінотрансфераза (AST, EC 2.6.1.1) та аланінамінотрансфераза (ALT, EC 2.6.1.2) вимірювали, використовуючи методи, описані нижче в "Аналізі" (експеримент 3) .
Нарешті, було оцінено, чи може CT-II знизити ожиріння у щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру. Щурів, у яких ожиріння було викликано дієтою з високим вмістом жиру, вагою 570–718 г, розділили на дві групи. Контрольна група (середня вага тіла, 643 г) продовжувала отримувати лише цю дієту. Друга група (середня вага тіла, 641 г) отримувала дієту з високим вмістом жиру із змішаним CT-II у концентрації 2,0%. Вагу тіла вимірювали щотижня. Після 4 тижнів лікування протягом 3 днів вимірювали споживання їжі, загальне вироблення жиру в калі та загальний холестерин у калі. Після 12 тижнів лікування через 12 годин голодування забирали кров із серця, плазму відокремлювали і заморожували до аналізу (TG, TC, глюкоза, AST, ALT та інсулін; експеримент 4).
нариси
Глюкозу аналізували методом глюкозооксидази. Загальний холестерин (TC), тригліцериди (TG), аспартатамінотрансфераза (AST) та аланінамінотрансфераза (ALT) аналізували сухим хімічним автоаналізатором (AU-5200, OLYMPUS). Інсулін визначали імунологічним аналізом. 12 Вимірювали вагу органу (параметричний жир, печінку, серце та нирки) та реєстрували у відсотках від кінцевої маси тіла разом із абсолютними значеннями. Загальний жир туші визначали шляхом вилучення ліофілізованого гомогенату з туші без шкіри. З туші зняли шкіру, а підшкірний жир, що прилип до шкіри, зішкреб гострим ножем або шпателем. Тушку без шкіри та підшкірний жир об'єднували та гомогенізували, провівши двічі через м'ясорубку (м'ясорубка β10, BONNY Inc.) із сітчастою пластиною 3,2 мм, а потім ліофілізували. Екстракцію ліпідів ліофілізованого гомогенату туші без шкіри проводили методом Folch 13, а екстракти випаровували у вакуумі та зважували. Загальний вміст жиру розраховували як абсолютну величину та відсоток кінцевої маси тіла.
Статистичний аналіз.
Дані виражали як середнє значення ± se та аналізували за допомогою критерію Стьюдента та Аспіна-Велча ANOVA, або одноразових повторних вимірювань ANOVA, де це доречно; Значення р 
Вплив CT-II на активність ліпази. Активність ліпази вимірювали з використанням свинячої панкреатичної ліпази та тріолеїну в якості субстрату. Інгібуючий ефект був продемонстрований як зменшення відносної активності (%) порівняно з активністю ліпази у контролі (0 мг/мл CT-II).
Повнорозмірне зображення
На малюнку 2 показано швидкість приросту маси тіла нежирних щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру, з або без CT-II (експеримент 2). Приріст тих, хто харчувався дієтою, що містить 2,5% CT-II, був значно пригнічений від 1 до 8 тижнів під час лікування (P
Вплив CT-II на збільшення маси тіла у худих щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру. Значення - це середнє значення ± se (%) (n = 6). Зміни приросту маси тіла у кожному періоді лікування відображаються у відсотках до базової маси тіла. (•) контроль; (▴) CT-II 2, 5% у дієті. *** Вкажіть суттєві відмінності в тесті Стьюдента та Аспіна-Велча, які порівнюють 2,5% групи CT-II з контрольною групою (0% CT-II) (* P
Порівняння гістології печінки у нежирних щурів, які харчувались жирною дієтою після 8 тижнів лікування CT-II. Багато крапель жиру, що відображаються як великі білі сфери в необроблених контрольних елементах, були видалені або зменшені в розмірі.
Повнорозмірне зображення
Дозозалежні ефекти збільшення маси тіла щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру з CT-II та без неї, показані в таблиці 2. CT-II пригнічує збільшення маси тіла залежно від дози. Швидкість набору ваги у чотирьох груп, які отримували дієту, що містила 1,0–3,5% CT-II, була значно придушена (P
Вплив CT-II на збільшення маси тіла у ожирілих щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру. Значення - це середнє значення ± se (%) (n = 6). Зміни приросту маси тіла у кожному періоді лікування відображаються у відсотках до базової маси тіла. (•) контроль; (▴) CT-II 2,0% у дієті. *** Вкажіть суттєві відмінності у тесті Стьюдента та Аспіна-Велча, які порівнюють 2,0% групи CT-II з контрольною групою (0% CT-II) (* P 2,14, і було показано, що вони мають -обезова та антигіперхолестеринемічна активність на різних моделях тварин, 15, 16 та у людей. 3, 4, 5 Повідомлялося, що 50% інгібування активності ліпази було отримано від 0,63 до 0, 85 до 0,1 мкг/мл частково очищеної свинячої підшлункової залози ліпаза в системі аналізу ліпази.2
В експерименті 2 введення CT-II пригнічувало збільшення маси тіла у нежирних щурів, які годувались жирною дієтою залежно від дози. Це гальмування не залежало від зменшення споживання їжі, оскільки не було різниці в кількості споживаної їжі між щурами, які отримували CT-II і не отримували CT-II. ТГ у плазмі крові також знижується залежно від дози. АСТ і АЛТ були знижені через 2 тижні лікування CT-II, а гістологія печінки через 2 місяці лікування показала поліпшення жирової печінки. Результати також показали, що лікування КТ-II запобігало жирову печінку.
Тест балансу між введеним жиром та жиром, що виділяється зі стільцем після 4 тижнів лікування, показав збільшення останнього, що свідчить про пригнічення внутрішньошлунково-кишкової ліпази CT-II, що могло б бути результатом придушення гідролізу та всмоктування тригліцериди, як показано in vitro у цьому дослідженні. Тому пригнічення активності ліпази підшлункової залози також було продемонстровано in vivo. Також збільшилося виведення холестерину з калом. THL пригнічує активність холестерилестерази та ліпази. Отже, існує ймовірність того, що пригнічення холестерину II-холестерину за допомогою CT-II пригнічується пригніченням холестерину. Однак CT-II не знижував рівень холестерину в плазмі, хоча і збільшував виведення холестерину зі стільцем, тому для розуміння цього спостереження потрібні додаткові дослідження.
Несприятливим ефектом інгібітора ліпази THL є дуже часта поява діареї у людей. 3, 5 Однак у щурів, які отримували CT-II у цьому дослідженні, не виявляли діареї або ненормального хімічного складу крові, що свідчить про те, що екстракт має менше побічних ефектів, ніж THL.
Підводячи підсумок, інгібітор ліпази CT-II був ефективним у профілактиці та поліпшенні ожиріння, жирової печінки та гіпертригліцеридемії у щурів, які отримували дієту з високим вмістом жиру. Результати свідчать про те, що CT-II може бути корисною речовиною для профілактики та лікування ожиріння та гіпертригліцеридемії у людей.