метастазування

  • предметів
  • реферат
  • Передумови:
  • методи:
  • результати:
  • висновок:
  • Головний
  • результат
  • Ензастаурин пригнічує ріст клітин НМРЛ людини
  • Ензастаурин впливає на міграцію та інвазію клітин
  • Аналіз змін експресії генів після лікування ферментами
  • Ензастаурин пригнічує експресію гена u-PAR у клітинах NSCLC
  • нокдаун u-PAR ресенсибілізує клітини NSCLC та індукує апоптоз на Enz
  • Ензастаурін у природніх умовах зменшує віддалені метастази в клітинах NSCLC
  • обговорення
  • Історія змін
  • Додаткова інформація
  • Файли Powerpoint
  • Додаткова фігура 1
  • Додатковий малюнок 2
  • Додатковий малюнок 3
  • Додатковий малюнок 4
  • Документи Word
  • Додаткова таблиця 1
  • Додаткова таблиця 2
  • Додаткова таблиця 3
  • Додаткові легенди зображення

предметів

  • біомаркери
  • Регуляція генів
  • Молекулярно-цілеспрямована терапія
  • Недрібноклітинний рак легенів

Ця стаття оновлена

реферат

Передумови:

Ензастаурин (Enz) - це інгібітор серин/треонінкінази, який блокує протеїнкіназу С (РКС) ß/АКТ. Однак здатність цієї сполуки інгібувати інвазію раку та метастазування не з’ясована до кінця.

методи:

Здатність Enz інгібувати інвазію та метастазування та молекули-мішені досліджували при недрібноклітинному раку легенів (NSCLC) за допомогою мікрочипів, Matrigel та in vivo хоріоналантоїсної мембрани (CAM) за допомогою RT-PCR.

результати:

Ензастаурин суттєво зменшив міграцію, інвазію та метастази в легені та печінку in vivo (аналіз CAM) різних клітинних ліній NSCLC. Гени, що сприяють прогресуванню раку (u-PAR, VEGFC та HIF1α) та супресії пухлини (VHL, RASSF1 та FHIT), НДКРЛ були значними (P -1 -1) до збирання клітин. В результаті ми виявили, що лікування Enz може інгібувати фосфорилювання PKC, AKT, p42/44 та GSK3β у присутності та відсутності EGF (рисунок 1C, додатковий малюнок 1).

Ензастаурин пригнічує проліферацію, міграцію та інвазію НДКРЛ. ( A ) Проліферація клітин NSCLC після лікування Enz. Дані виражаються у відсотках контрольних (оброблених DMSO) клітин. Бали, середнє значення ± sd з трьох експериментів. Отримані значення IC 50 для Enz для всіх досліджених клітинних ліній NSCLC показані в коробці. ( B ) Аналіз апоптозу H460, A549, H1299 після лікування Enz. Після 48 годин лікування Енц клітини скринінгували за допомогою проточної цитометрії та відраховували відсоток апоптотичних клітин щодо оброблених ДМСО клітин. ( C. ) Вестерн-блот-аналіз клітин, оброблених EGF, Enz або комбінацією обох реагентів. Специфічні антитіла проти зазначених молекул використовували разом з анти-бета-актином як контрольний елемент навантаження. ( C. a D ) Відсоток мігруючих клітин (тест на лікування) та інвазивних клітин (тест Матрігеля). Клітини обробляли, як описано в Матеріали та методи. Зразки, оброблені ДМСО, служили контролем (100%), а інші оброблені зразки були розраховані та побудовані як відсотки від цієї величини. * P

Ензастаурин індукує експресію генів супресорів пухлини. Кількісна оцінка ( A ) VHL, ( B ) RASSF1 a ( C. ) FHIT FHIT у клітинах H460 та A549 в режимі реального часу після 24-48 годин обробки ДМСО або Enz (IC50). Відносна експресія генів нормалізувалась щодо мРНК β-актину. * P

Вплив ензастаурину на експресію проінвазивних генів. Кількісна оцінка ПЛР ( A ) HIFla, ( B ) VEGFC і ( C. u-PAR у клітинах H460, A549 та H1299 у режимі реального часу після 24-48 годин обробки ДМСО або Enz (IC50). Відносна експресія генів нормалізувалась щодо мРНК β-актину. * P

Ензастаурин пригнічує активність промотору u-PAR та експресію білка u-PAR. ( A ) Загальний білок u-PAR, оцінений методом ІФА, як описано в Матеріали та методи. Кожне значення являє собою середнє значення триразових вимірювань. ( B ) Визначення активності люциферази для клітин H460, A549 та H1299. Дані представлені як середнє значення ± sd трьох незалежних експериментів, проведених у чотирьох повторах. * P

Ензастаурин пригнічує метастази НДКРЛ in vivo. ( A - C. ) Кількість метастатичних клітин у печінці та легенях курячих ембріонів, оброблених внутрішньовенно з різними концентраціями Enz (2 або 4 мкМ) або DMSO. Послідовності Alu людини ампліфікували та кількісно визначали за допомогою ПЛР у режимі реального часу. ** P * P  0,05.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Це дослідження показує, що Enz інгібує міграцію, інвазію та метастази in vivo при НМРЛ, і досліджує перші механізми, що сприяють гальмуванню індукованої Enz міграції, інвазії та метастазування у НМРЛ. Ми показуємо, що Enz транскрипційно пригнічує експресію гена u-PAR, знижує регуляцію молекул HIF1 α та VEGFC, пов'язаних з прогресуванням пухлини, а також регулює гени VHL, RASSF1 та FHIT, що пригнічують пухлину. Отримані нами дані також дозволяють припустити, що нокдаун si-u-PAR/sh-u-PAR сенсибілізує стійкі клітини NSCLC до Enz та індукує апоптоз. Ці дані свідчать про те, що лікування Enz у пацієнтів з НДКРЛ може сприяти збільшенню виживання шляхом інгібування генів прогресування пухлини та індукції генів супресорів пухлини.

У своїй роботі ми показали, що Enz інгібує віддалені метастази в печінку та легені in vivo в аналізі CAM. На додаток до його проапоптотичних, інгібуючих зростання та антиангіогенних властивостей (Keyes et al., 2002; Graff et al., 2005; Querfeld et al., 2006; Willey et al., 2009), це може бути, принаймні в частина, завдяки зниженню регуляції. Гени прогресування та інвазії пухлини (гени u-PAR, HIF1α та VEGFC) та регуляція генів-супресорів NSCLC (FHIT, RASSF1 та VHL) за допомогою Enz. Ми вважаємо малоймовірним, що основний механізм пригнічення метастазів Enz можна пояснити антиангіогенезом, оскільки ми виявили, що пробки, занурені в DMSO або Enz, не продемонстрували суттєвої різниці у своєму впливі на формування ембріональної судинної системи верхньої CAM (дані не показано). Однак антиангіогенний компонент Enzo в контексті антиметастатичної активності в нашій моделі, безумовно, не може бути повністю виключений.

Загалом, це перший всебічний аналіз для дослідження диференційовано регульованих генів у клітинах NSCLC після лікування Enz та залучення нових цілей Enz в контексті міграції, інвазії та віддалених метастазів у NSCLC. Наші результати показують, що Enz відіграє важливу роль у зниженні регуляції u-PAR за допомогою Sp1/Sp3 та c-Jun (AP-1), на додаток до HIF1 та VEGFC, які беруть участь у зростанні та метастазуванні пухлини, паралельно регуляція придушення пухлини. що стосуються НМРЛ. Крім того, нокдаун u-PAR ресенсибілізує клітини NSCLC до лікування Enz. Ці висновки дають важливу інформацію для поточних клінічних випробувань з Enz у пацієнтів з НДКРЛ та інших досліджень, що вивчають зразки тканини або крові пацієнтів, які отримували Enz, такі як розчинні у сироватці крові u-PAR або u-PAR (Henic et al, 2008), як потенційно рекомендує клінічно значущий маркер стійкості до лікування.