Ферменти: прискорювачі хімічних реакцій у клітинах та в промисловості

Вступ

Порівняно проста клітина, така як бактерія Escherichia coli, може виробляти понад 4000 різних білків. Після води білки є найпоширенішими молекулами в клітинах (

15% маси бактерії). Клітина - це сукупність тисяч молекул, що знаходяться в постійному русі та організовані в певні структури. Ця колекція включає білки, нуклеїнові кислоти, полісахариди, ліпіди, метаболіти та невеликі іони, такі як натрій, калій та магній. Анімацію, що демонструє різноманітність процесів, що відбуваються постійно в клітині, можна побачити у наступному відео:

Ферменти мають надзвичайно різноманітні функції всередині клітини: вони розкладають цукру, синтезують жири та амінокислоти, достовірно копіюють генетичну інформацію, беруть участь у розпізнаванні та передачі зовнішніх сигналів і відповідають за погіршення токсичних побічних продуктів для клітини, серед багатьох інших життєво важливих функцій. Ідентичність і фізіологічний стан живої істоти визначається набором ферментів, які діють з точністю хірурга та зі швидкістю блискавки в будь-який момент у клітинах. Таким чином, за мільйони років еволюції природа розробила велику різноманітність ферментів для підтримки складного явища життя.

Наскільки ефективні ферменти? Як вони працюють?

Існує кілька способів виміряти ефективність ферменту. Найпростіше визначити, наскільки швидко відбувається реакція з точки зору того, скільки молекул субстрату перетворюється в секунду, як у прикладі карбоангідрази. Порівнюючи швидкість проходження каталізованої реакції проти відсутності ферменту, ми можемо оцінити ефективність ферментів як прискорювачів реакції. Інший спосіб - врахувати час, який потрібен реакції. На сьогодні найефективніший фермент каталізує декарбоксилювання субстрату, який називається оритидин-5'-фосфат (ОМФ), і називається ОМР-декарбоксилаза. Некаталізована реакція займає 78 мільйонів років. На щастя, фермент ОМР-декарбоксилаза пришвидшує реакцію в 10-17 разів, тож це відбувається лише за 25 тисячних частки секунди. Ця реакція є дуже важливою, оскільки вона є частиною виробничого ланцюга нуклеотиду уридинмонофосфату, одного з 4 компонентів рибонуклеїнової кислоти (РНК, для її скорочення англійською мовою).

Як ферменти виконують цю роботу? Пам’ятайте, що ферменти - це білки, полімери амінокислот, які мають визначену тривимірну структуру. Його активність, що включає взаємодію з підкладкою, залежить від її тривимірної структури. Якщо це змінити, каталітична здатність може бути погіршена. Щоб краще зрозуміти, як білок згортається або згинається в просторі, були розроблені обчислювальні інструменти для моделювання цього явища. Моделювання згортання невеликого білка можна побачити в наступному відео:

Тепер, що направляє або визначає згортання білка? Білки елегантно складаються залежно від послідовності амінокислот (їх називають амінокислотними залишками, оскільки вони є частиною білка), що їх складають, а між їх складками та кривими вони утворюють певні порожнини або ділянки, споріднені до різних молекул. У випадку з ферментами саме в цих місцях відбувається хімічна реакція. Ось дуже добре зроблене відео, яке демонструє моделювання взаємодії між білками та малими молекулами:

Щоразу, коли група вчених визначає тривимірну структуру білка, він зберігається на веб-сайті, який називається "Банк даних білків" (PDB). З цього сайту ми вибрали галерею ферментів, яка показана на наступному малюнку, висвітлюючи вишуканість та красу деяких складок, відомих на сьогодні (Рисунок 1). Усі ці чудові погляди на білки зумовлені досягненнями структурної біології, яка є відносно молодою наукою, про що ми згадаємо в наступному розділі.

Фігура 1. Галерея ферментів. Карбоангідраза підтримує рН нашої крові (PDB 1CA2). Люцифераза була виділена з медузи, а також відповідає за біолюмінесценцію у світлячків (PDB 2D1S). Алкогольдегідрогеназа розщеплює алкоголь, який ми вживаємо, він виробляється в печінці (PDB 1AGN). Тріосефосфат-ізомераза має важливе значення в метаболізмі цукрів (PDB 2YPI). Цитохром P450 модифікує деякі ліки та токсичні сполуки, які потрапляють у наш організм (PDB 1W0E). Отримано з PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do).

Ферментативні механізми, що прискорюють реакцію, дуже різноманітні. Дві найпростіші та найінтуїтивніші - це "підхід" та "орієнтація". Як і в будь-якій хімічній реакції, реагенти повинні зіткнутися один з одним з достатньою кількістю енергії і в правильній орієнтації, щоб зв’язки між молекулами розірвалися або утворились. Оскільки ці зіткнення відбуваються абсолютно випадково, не всі вони є продуктивними, тобто не всі викликають хімічну реакцію. Як вже згадувалося раніше, ферменти мають порожнини, в яких можна вмістити субстрати для реакції один з одним. Вони складають "активний центр" ферменту. На цьому місці знаходяться специфічні амінокислотні залишки, які дозволяють взаємодіяти з субстратами та сприяють розриву та утворенню нових зв’язків.

Деякі ферменти включають у свою структуру метали (наприклад, іони заліза, міді та цинку, серед інших), які можуть брати участь у каталітичному процесі. З цієї причини дуже важливо підтримувати тривимірну структуру ферменту, оскільки положення та орієнтація амінокислотних залишків та інших кофакторів (тобто металів) визначають, відбудеться реакція чи ні. Субстрати, взаємодіючи з активним центром ферменту, знаходяться ближче один до одного (механізм підходу), а також орієнтуються певним чином (механізм орієнтації). Це наче субстрати мають шаблон або шаблон (тобто активний сайт ферменту), де вони можуть «вкластись» у зустрічі та реакцію, а не покладаючись на випадкові зіткнення. Таким чином, присутність ферменту забезпечує інший спосіб, за допомогою якого протікає певна хімічна реакція. Як правило, цей механізм вимагає менше енергії, і тому хімічна реакція протікає швидше у присутності ферменту. Дуже наочне відео, яке ілюструє цей процес, можна переглянути тут:

Ще однією дуже важливою характеристикою ферментів є їх специфічність, тобто те, наскільки добре вони можуть розпізнавати субстрат - і лише цей субстрат - у присутності інших молекул. Ця здатність розрізняти сотні різних молекул - ще одна причина, чому тривимірна структура ферментів є ключовою для їх функціональності. Якби структура активного центру була занадто гнучкою та динамічною, спорідненість до субстрату була б дуже низькою, і реакція протікала б не так швидко. У цьому сенсі однією з проблем білкової інженерії є розуміння складки білків з метою знання того, як маніпулювати стабільністю структури та вдосконалювати її. Оскільки ферменти - це білки, призначені еволюцією для функціонування в дуже обмежених умовах всередині клітин (тобто 30-37 ° C, атмосферного тиску або водного середовища), коли вони повинні використовуватися в інших реакційних умовах (високі температури, середовище з органічними розчинниками або при механічному перемішуванні), як правило, втрачають свою структуру і, отже, свою активність.

Як були відкриті ферменти?

Історія вивчення ферментів на молекулярному рівні досить свіжа. За часів Гансена вчені вже відчували, що всередині клітин є «щось», що відіграє важливу роль у хімічних перетвореннях, що там відбувалися. Вчені називали ці речовини «ферментами». Навіть Берцеліус, шведський хімік, запропонував у 1835 р., Що бродіння мають каталітичну роль. Однак вважалося, що вони працюють лише завдяки наявності живих клітин, що дає їм "життєву силу", яка робить їх активними. Лише в 1897 р. Було переконливо показано, що клітинні ферменти або екстракти за відсутності живих клітин каталізують реакції. Цим відкриттям ми завдячуємо Едуарду Бухнеру, німецькому вченому, який був удостоєний Нобелівської премії з хімії в 1907 році за те, що продемонстрував, що безклітинні екстракти дріжджів можуть каталізувати спиртове бродіння, тобто перетворення цукру в спирт. Бухнер припустив, що ферменти повинні бути білковими за своєю природою 1 .

У 1926 році Джеймс Б. Самнер, американський учений, вперше очистив і кристалізував фермент уреазу, показавши, що це білок, і перевірив ідею Бухнера. За свої висновки Самнер отримав Нобелівську премію з хімії 1946 року разом з Джоном Х. Нортропом і В.М. Стенлі, також американські вчені, які в 1930 році очистили 2 інших ферменти. Пізніше, додавши до злету структурної біології, вчений Девід Чілтон Філліпс вперше визначив у 1965 році тривимірну структуру ферменту лізоциму, використовуючи рентгенівську дифракційну картину кристала ферменту. Це представляло величезний прогрес, оскільки завдяки цій техніці можна детально дізнатися молекулярну структуру ферментів і на її основі формувати гіпотези про те, як вони працюють, проектувати зміни в конкретних залишках для маніпулювання їх властивостями (каталітична ефективність, специфічність або стабільність, серед інших), або моделюють їх руху та взаємодію з іншими молекулами.

Це, безумовно, був захоплюючий час як з наукової, так і з технологічної точки зору. У 1913 році була опублікована класична стаття Майкеліса та Ментена, в якій пропонується модель, яка пояснює кінетичну поведінку ферментів. Ця математично дуже проста модель описує, як швидкість ферментативно каталізованої реакції зростає із збільшенням концентрації субстрату. Швидкість наближається до максимуму, коли передбачається, що активні центри насичені, і тому реакція не може протікати з більшою швидкістю. Прокоментовану версію статті, якій щойно виповнилося сто, можна отримати за адресою: http://academics.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/initialvelocity.html. Варто згадати, що переважна більшість ферментів має кінетичну поведінку, близьку до цієї моделі, або має її варіанти. Насправді це основна модель, яку сьогодні викладають на курсах ферментології у всьому світі. Отже, як можна бачити, на початку минулого століття стіл вже був накритий для повного розуміння функціонування ферментів.

1 Щоб дізнатись більше про цього вченого, ви можете переглянути сторінку Нобелівських лауреатів (http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/)

Як можна використовувати ферменти?

Всі ці технологічні програми неможливі без масштабного, недорогого виробництва ферментів. Генна інженерія мала важливе значення в цьому відношенні. Завдяки цьому засобу можна витягти з організму ген (утворений дезоксирибонуклеїновою кислотою, ДНК для її абревіатури англійською мовою), який кодує певний фермент, і ввести його в генетичний матеріал іншого організму.

Це вражаюче відкриття, яке заклало наукову основу сучасних біотехнологій, було зроблено в 1973 р. Групою дослідників з Каліфорнійського університету в Сан-Франциско (COHEN et al., 1973). Як правило, ДНК вводиться в мікроорганізм, який швидко росте і виробляє велику кількість цікавого білка. Той, що виробляється цією методикою, називається рекомбінантним білком. Бактерії - ідеальні кандидати для цього завдання. Вони розмножуються в геометричній прогресії, їх легко генетично маніпулювати і для зростання їм потрібні дешеві поживні речовини. Наприклад, цитохроми P450 - це ферменти, які містять залізо в своєму активному центрі і здатні каталізувати окислення найрізноманітніших органічних сполук, використовуючи кисень як окислювач. У людей багато цитохромів, які допомагають нам розщеплювати токсичні сполуки, що потрапляють у наш організм. Якби ми хотіли глибоко вивчити ці молекули, отримати їх безпосередньо з нашого тіла було б дуже важко і дорого. Ось чому методи генної інженерії дозволили продукувати велику кількість цитохромів людини в кишковій паличці.

На додаток до цієї популярної бактерії, можна експресувати або виробляти білки з багатьох живих істот у грибах, таких як дріжджі Saccharomyces cerevisiae або навіть у клітинах комах. Якщо в середині 20 століття (приблизно 1960 р.) Близько 70% комерційних ферментів отримували з рослин і органів тварин, то сьогодні 90% походять від мікроорганізмів, і більшість ферментів для промислового використання (понад 50%) виробляються рекомбінантно (ILLANES, 2010).

Завершення

Бібліографія

COHEN SN, Chang ACY, Boyer HW & Helling RB. "Побудова біологічно функціональних бактеріальних плазмід in vitro" Праці Національної академії наук США, 1973, 70, 3240–3244.

----- Андрес Ілланес (редактор). Біокаталіз ферментів: принципи та застосування. Спрінгер, 2010 рік.

GOEDDEL та ін. "Експресія в кишковій паличці хімічно синтезованих генів людського інсуліну". Праці Національної академії наук США, 1979, 76, 106–110.

JOHNSON KA & Goody RS. "Оригінальна константа Міхаеліса: переклад статті 1913 року Міхаеліса-Ментена". Біохімія, 2011, 50, 8264-8269.

• Як працюють безмасляні фритюрниці? Чи здоровіші вони, ніж традиційні фритюрниці? Cocina La
• Менеджери завантажень, як вони працюють, та безкоштовна пропозиція
• Гомеопатія для схуднення Як це працює
• Каша дружби в мультиварці як готувати з водою або молоком
• Футбольні стадіони, як їсти і не вмирати, намагаючись