транскрипції

  • предметів
  • реферат
  • вступ
  • результат
  • Сигналізація RA в DC контролює розвиток кишкового cDC
  • RA керує створенням в пробірці кишкові підгрупи cDC1 та cDC2
  • RA контролює стенограми в пробірці отримані cDC1 та cDC2 щодо фізіологічних закономірностей експресії генів.
  • RA контролює експресію факторів транскрипції, що беруть участь у диференціації cDC
  • Надмірна презентація сайтів зв'язування NF-κB/REL у генно-пригнічених генних промоторах RA
  • обговорення
  • методи
  • прирости
  • Ген експрес Омнібус
  • Додаткова інформація
  • Документи Word
  • Додаткові легенди зображення
  • Файли зображень
  • Додаткове зображення S1
  • Додаткове зображення S2
  • Додаткове зображення S3

предметів

  • Стільникова сигналізація
  • Дендритні клітини
  • Імунологія слизової оболонки
  • стенограма

реферат

Кишечник постійно піддається впливу мікробіотиків, перетравленої їжі та вторгнення збудників. Кишкові дендритні клітини (ДК) відіграють ключову роль в імунному гомеостазі, спрямовуючи імунні відповіді, відповідні кожному наявному антигену та стимулу. DC мають унікальну здатність відбирати та обробляти антигени та транслювати мікросередовище сигналів для Т і В-клітин шляхом представлення цитокінів та метаболітів, щоб викликати та регулювати імунну відповідь, або викликати або підтримувати толерантність.

Два переважні підмножини звичайних дендритних клітин (cDC) у тонкому кишечнику (SI) фенотипово ідентифікуються як CD11c + MHCII + клітини, які є або CD103 + CD11b - (cDC1), або CD103 + CD11b + (cDC2). Підмножини різняться за розвитком і вимагають різних факторів транскрипції. Хоча обидва процеси обробляють місцевий антиген, мігрують до дренуючих мезентеріальних лімфатичних вузлів (MLN), виробляють толерогенні або імуностимулюючі реакції та виштовхують Т-клітини в кишечник, вони також відрізняються функціонально: CDC2 експресують TLR5, який розпізнає флагелін, і є кращими індукторами. Клітини Th17 та синтези IgA та cDC1 експресують TLR3, зразковий рецептор дволанцюжкової вірусної РНК, і демонструють Clec9A та XCR1, рецептори, причетні до спеціалізованої здатності cDC1 перехресно представляти асоційовані з клітиною антигени до CD8 Т-клітин in vivo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Обидві підгрупи можуть бути отримані з фенотипово різних попередників кісткового мозку (BM), 10, 11, включаючи попередньо слизовий DC (pre-μDC), кишковий попередник, який може призвести до підмножин cDC, а також до плазмоцитоїдного постійного струму. Pre-μDC експресує кишковий провідний рецептор α4β7, переважно мігрує у власну пластинку кишечника (LP) та ефективно заповнює запаси cDC кишечника.

Тут ми намагалися визначити, чи РА також стимулює подальший розвиток pre-μDC, та вивчити його внесок у спеціалізацію кишкових підгруп cDC. Наші результати показують, що внутрішньоклітинна сигналізація RARα регулює вироблення cDC в кишечнику перед μDC і відіграє центральну роль у програмуванні транскрипції cDC1 та cDC2. Далі ми показуємо, що в поєднанні з гранулоцит-макрофаговим колонієстимулюючим фактором (GM-CSF) та Flt3L, RA направляє ефективне виробництво cDC in vitro з унікальними характеристиками кишкових cDC1 та cDC2 з їх кишкових попередників pre-μDC.

результат

Сигналізація RA в DC контролює розвиток кишкового cDC

Ми спочатку оцінили кДК у мишей з дефіцитом вітаміну А (VAD), які годувались VAD дієтою протягом 12 тижнів після матки. 17 VAD впливав як на фенотипи, так і на представництво кишкових підгруп cDC. Частота та кількість cDC2 (CD103 + CD11b +) були зменшені як у SI LP, так і в мезентеріальних лімфатичних вузлах мишей C57BL/6, порівняно з мишами на контрольній дієті (рис. 1а, b). Подібні результати були отримані у мишей BALB/c (додаткове зображення Sla в Інтернеті) та у мишей C57BL/6, які годувались дієтою VAD, починаючи після відлучення (додаткове зображення S1b). На відміну від підмножин CD103 + cDC, змішана популяція CD103 - CD11b +, яка складається з макрофагів і менших популяцій CDC кишечника CD103, хоча і відрізняється за кількістю та частотою в наших дослідженнях, не показала стійкої різниці між мишами контролю та VAD ( дані не відображаються). Критична оцінка впливу РА на розвиток макрофагів потребуватиме досліджень з іншими маркерами макрофагів.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

RA впливає на кілька типів клітин кишечника, включаючи стромальні клітини та епітелій, і може побічно впливати на cDC. Щоб визначити, чи є це властива RAC-сигналізація, ми сконструювали мишей, щоб експресувати домінуючий негативний RARα, RAR403, під контролем промотору CD11c шляхом схрещування мишей CD11c-Cre з мишами, що несуть RAR403 нижче за течією касети STOP з фланками lox. . (dn Rara lsl/lsl). 29 У цих "мишей DC-RAR403" було значне зменшення абсолютного числа cDC2 та співвідношення cDC2/cDC1 у SI LP та мезентеріальних лімфатичних вузлах порівняно з їх послідами дикого типу (WT) (Рис. 2a), і ці ефекти були більш вираженими у мишей, які мали дві копії гена RAR403 (DC-RAR403 fl/fl) порівняно з однокопійними мишами (DC-RAR403 fl/-). Як і у мишей VAD, субпопуляція кишкових клітин cDC1 у мишей DC-RAR403 експресувала CD207 (Langerin) (рис. 2b). Результати дозволяють припустити, що RA діє внутрішньо на клітини кишкового cDC1 та cDC2, впливаючи тим самим на їх фенотип та розвиток. Однак, як повідомляється, підмножини кишкових макрофагів демонструють рекомбінацію cre у 30 мишей CD11c-cre і можуть експресувати RAR403 у нашій моделі; тому не можна виключати опосередкований вплив макрофагів на фенотипи кДК.

Ефекти дендритних клітин (DC) - обмежена відсутність сигналів ретиноевої кислоти (RA) на DC тонкої кишки (SI). a ) Співвідношення cDC2 до cDC1 у власній пластинці SI (LP) та MLN та кількість cDC2 у SI LP DC-RAR403 -/- (стандартний тип (WT)), DC-RAR403 fl/- (гетерозиготний) та DC - RAR403 fl/fl (гомозиготні) миші. ( b ) аберрантна експресія CD207 на SI cDC1 від мишей DC-RAR403. Наведені репрезентативні графіки, що ілюструють клітини експресії CD207 з використанням SI cDC1 від мишей DC-RAR fl/fl (клітини всередині ворота CD207 + зображені великими крапками для ілюстрації). Графік розсіювання показує відсоток cDC1 у СІ, який виражає CD207. Непарний односторонній t-тест. cDC, звичайна дендритна клітина; MLN, брижові лімфатичні вузли.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

КДК селезінки також зазнав впливу на мишах DC-RAR403 (додаткова фігура S2). Як і у DC мишей DC-RAR403, підмножина CD8a + cDC1 селезінки у мишей DC-RAR403, але не в контрольних групах WT, виражає Лангерін (CD207) (додатковий малюнок S2a). Кількість CD11b + і CD8a + cDC була зменшена в селезінці мишей DC-RAR403, але співвідношення CD11b + cDC до CD8a + cDC не змінилося порівняно з метателями WT (додатковий малюнок S2b і дані не показані). Однак cDC, що експресує Clec4a4 (DCIR2, розпізнаний Mab 33D1, класичним маркером cDC2), був значно знижений, що призвело до зменшення відношення cDC2 до cDC8a + cDC1, визначеного Clec4a4 (додаткова фігура S2c). Підгрупа Clec4a4 +, яка сильно зменшена в кількості мишей DC-RAR403, також експресувала Esam у мишей WT (додатковий малюнок S2d). Таким чином, клітинна внутрішня RAR-сигналізація впливала як на cDC1, так і на cDC2 в селезінці, а також на SI.

Результати вказують на те, що сигнали RAR, властиві постійному струму, регулюють розвиток і фенотипову спеціалізацію підмножин cDC як в кишковому, так і в позакишковому відділах, але підтримують особливо важливу роль RA у визначенні кишкових фенотипів cDC та регіональну спеціалізацію в проксимальних СІ та мезентеріальних лімфоклітинах дренаж. вузли, де концентрація РА висока.

RA направляє in vitro на формування кишкових підгруп cDC1 та cDC2

Ретиноева кислота (RA) контролює утворення окремих підгруп DC-подібних дендрактичних клітин (DC) in vitro. ( a - c ) Попередньо слизові DC (pre-μDC) сортували від мишей BM, яким вводили Flt3L, і культивували в повному обсязі модифікованого середовища Deulbecco Iscove з 10% деліпідованою сироваткою, доповненою Flt3L та фактором стимулювання колонії гранулоцитів-макрофагів (GM) -CSF) або 100 нМ RA (або AM580 дюйма) c ), якщо не вказано інше. Культури збирали на 4 день та аналізували за допомогою проточної цитометрії. a ) Показані поверхневі маркери та активність ретинальдегіддегідрогенази (RALDH), зазначені фарбуванням AldeFluor на кишковому та in vitro похідному cDC1 (пунктирна лінія) та cDC2 (суцільна лінія). Представник принаймні трьох незалежних експериментів. ( b ) Експресія Clec9a на in vitro похідному cDC1 та CD101 на cDC2 з різними концентраціями RA. Представник двох незалежних експериментів. ( c ) Зазначено співвідношення cDC2 до cDC1, кількість клітин загального потомства та кількість cDC1 та cDC2 у культурах, оброблених зазначеними концентраціями RA або AM580. Дані зібрані в результаті трьох незалежних експериментів. cDC, звичайна дендритна клітина.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Однак додавання RA призвело до утворення cDC1 та cDC2 з ключовими фенотиповими особливостями двох підгруп cDC кишечника, включаючи TLR3 на cDC1 та CD101 на cDC2, а також експресію ретинальдегіддегідрогенази обома підгрупами (рис. 3а). Ці результати свідчать про те, що GM-CSF, Flt3L і RA працюють разом, щоб подати критичні сигнали, необхідні для диференціації кишкових кДК від попередників BM. РА регулювання Clec9a для експресії cDC1 та CD101 у підгрупі cDC2 залежало від дози (рис. 3b).

RA викликала збільшення cDC2 in vitro, подібно до його ефекту in vivo. Коли пре-μDC культивували з різними концентраціями RA або агоніста RARα AM580 протягом 4 днів, присутність RA або AM580 збільшувала кількість cDC2, що утворюється, одночасно зменшуючи кількість cDC1, ефективно збільшуючи співвідношення cDC2/cDC1. Ефект RA залежав від дози, при цьому співвідношення cDC2/cDC1 зростало від 0 до 1 нМ RA, а плато зростало, коли концентрація RA досягала рівня, про який повідомляється для SI 25 (

10 нм). Оскільки на загальну кількість клітин потомства не впливали RA або AM580 (рис. 3c), результати узгоджуються з безпосередньою дією RA на RARα у попередниках постійного струму, щоб вплинути на їх долю.

У сукупності результати свідчать про критичну внутрішню роль РА у спеціалізації кишкового ЦДК та визначають умови культури для моделювання розвитку кишкового ЦДК.

RA спрямовує транскрипти in vitro cDC1 та cDC2 на фізіологічні закономірності експресії генів.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint
  • Завантажте слайд PowerPoint

RA контролює експресію факторів транскрипції, що беруть участь у диференціації cDC

Надмірна презентація сайтів зв'язування NF-κB/REL у генно-пригнічених генних промоторах RA

RA зазвичай активує експресію генів, але лікування RA пригнічує експресію багатьох генів, індукованих або виражених у нашій культурологічній моделі. Ми використовували Enrichr 38 для ідентифікації надмірно представлених мотивів зв'язування фактора транскрипції в промоторних областях генів, які були вдвічі нижчими в клітинах, оброблених RA, ніж у контрольних клітинах cDC1: найвищі показники отримали ядерний фактор-kB (NF-kB) та REL TFBS ( TRANSFAC) та модуль ШІМ JASPAR, P ≤ 10 −20 та −12 (див. Нижче)). Гени, регульовані RA, у cDC1 також були значно збагачені для генів, задіяних у прозапальних сигнальних шляхах, опосередкованих NF-κB (Wikipathways, P = 0, 00004). Мотиви NF-κB також були збагачені для промоторів RA-репресованих (подвійних або більше) генів у диференціюванні cDC2 (модуль ШІМ TRANSFAC та JASPAR; P 10-9). Таким чином, на додаток до своєї ролі у збільшенні продукції cDC2 в умовах in vitro, що сприяють диференціації cDC1 та cDC2, RA пригнічує прозапальні генні програми.

обговорення

Ми оцінили роль сигналів RA та RAR у генерації та програмуванні транскрипції кишкових спеціалізованих підгруп cDC з кишкових тропічних попередників in vivo, а також у новій моделі in citro розвитку cDC1 та cDC2. Отримані нами результати свідчать про те, що RA насправді діє на клітини, надаючи глобальний вплив на експресію генів у лініях cDC1 та cDC2, та керує транскрипційними програмами, які контролюють генерацію підгруп та експресію функціональних та фенотипових ознак, що визначають кишкову спеціалізацію cDC1 та cDC2. у природніх умовах. .

Комбінація Flt3L, GM-CSF та RA була достатньою для стимулювання розвитку in vitro кишкових пре-μDC до CD103 + cDC1 та cDC2, які були подібними за експресією рецепторів клітинної поверхні до двох підгруп, виявлених у стінці кишечника. Майєр та ін. 32 показали, що Flt3L та GM-CSF спільно підтримують розвиток IRF8 та Batf3 залежних CD103 + cDC, але ми виявили, що cDC1, отриманий до μDC, утворений у відсутність RA, мав аберрантний фенотип клітинної поверхні і був менш вирівняний з кишковим cDC1 . в експресії гена як cDC1, що генерується з усіма трьома факторами. Крім того, культура з РА дозволяє утворювати обидва кишкових ДК подібних популяцій. Відповідно до наших спостережень у мишей VAD, збільшення концентрації РА до рівня, зазначеного в проксимальній СІ (

10 нМ), збільшило співвідношення cDC2 до cDC1 серед нащадків до μDC in vitro. Більш високі концентрації ще більше збільшують фенотипову спеціалізацію, як зазначено, наприклад Поступова регуляція CD101 та Clec9a. Ці спостереження підтверджують критичну роль РА у нормальному розвитку кДК і узгоджуються з особливо важливою роллю РА у спеціалізації кДК в кишечнику та ГАЛТ, де концентрація вітаміну А найвища. Модель культури, описана тут, повинна сприяти подальшим дослідженням відповідних механізмів.

Наш транскриптомічний аналіз підтвердив, що потомство пре-μDC, культивованих з RA, відповідало кишковим cDC1 та cDC2 in vivo в експресії генів, ніж їх аналоги, культивовані лише з GM-CSF та Flt3L. Це було особливо очевидним при порівнянні підгруп на основі експресії генів, диференційовано експресованих cDC1 проти. cDC2 in vivo. Цікаво, що отриманий in vitro cDC2 більше відхилявся від аналогів in vivo, ніж cDC1, хоча він утворювався у присутності РА, припускаючи, що вони можуть бути особливо чутливими до місцевих впливів навколишнього середовища та залежати від них. Відповідно, попередні дослідження експресії генів cDC з кишечника, шкіри, лімфоїдних тканин та крові показали, що cDC2 з різних ділянок тканини набагато більше відрізняються в експресії генів, ніж cDC1. 37

Загалом, наші висновки пропонують сценарій, за якого регуляція кишкового РК РА починається з БМ, де він позитивно регулює розвиток попередника кишечника-попередника постійного струму, пре-μDC. Pre-μDC є домом і веде до cDC1 та cDC2 в SI. У кишковій стінці РА діє безпосередньо на pre-μDC, мабуть, за допомогою регуляції факторів транскрипції, що визначають долю, для збільшення продукції cDC2 та для контролю програм експресії генів у cDC1 та cDC2, що сприяє їх функціональній спеціалізації та здатності підтримувати імунний гомеостаз та імунна координація. реакції на вторгнення збудників.

методи

Проточна цитометрія. Зразки (одноклітинні суспензії) спочатку блокували флуоресцентно активованим буфером сортування клітин (збалансований сольовий розчин Хенка з 2% фетальної телячої сироватки), що містить 100-кратне розведення антитіл до мишачих рецепторів FcγIII/II (BD Bioscience, Сан-Хосе, Каліфорнія) ). і сироватки щурів для запобігання неспецифічного зв’язування моноклональних антитіл. Для фарбування використовували такі антитіла: CD3-PECy7/CD3-біотин (145-2C11), CD19-PECy7/CD19-біотин (ID3), NK1.1-PECy7/NK1.1-біотин (PK136), CD49b-біотин (DX-5), Ly6G-біотин (1A8), Ter-119-біотин (Ter-119), B220-PECy7/B220-біотин/B220-PerCPCy5, 5 (RA3-6B2), MHCII-AF700/MHCII-FITC (M5/114, 15, 2)/MHCII-біотин (2G9), CD11c-PB (N418), a4p7-APC/a4p7-PE (DATK32), CCR9-APC/CCR9-PE/CCR9-FITC (242503), CD103 - PE/CD103-APC (M290), CD11b-AF700 (M1/70), CD8a-PE (53-6, 7), CD45.1-PerCPCy5, 5/CD45.1-APC, CD45.2-FITC/CD45.2 -PerCPCy5,5 (RA3-6B2), CD135-PE/CD135-PerCP-efluorF710 (A2F10), CD4-AF700 (RM4-5), Sirpa-FITC/Sirpa-PerCP-eFluor710 (P84), TLR3 - PE (11F8)), Clec4a4-PE/Clec4a4-біотин (33D1), CD101-PE (Mousei101), Clec9a-PerCP-eFluor710 (44D2) та Langerin-FITC. Всі експерименти, що аналізують підгрупи cDC, включали попередній затвор, CD3e-, CD19-, NK1.1-, MHCII + та CD11c + .

Виділення клітин з тканин

Сортування комірок. Pre-μDC та pre-cDC були відсортовані від мишей, оброблених B16/Flt3L. 11 клітин BM було виділено, як описано вище, і збагачено магнітно-активованим сортуванням клітин із використанням наборів pan-DC від Miltenyi (Сан-Дієго, Каліфорнія). Потім клітини сортували за Aria II або III (BD) для лінії (CD3, CD19) та NK1.1) -CD11c int B220 + a4β7 + CCR9 - попереднього μDC та лінії (CD3, CD19, NK1.1 та B220 ) - CD11c int MHCII-Sirpa + pre-cDC.

Прийнятна передача. Відсортовані попередні μDC (0, 5–1 x 106; CD45.2 або CD45.1) вводили ретроорбітно реципієнтам (CD45.1 або CD45.2). Приємних тварин приносили в жертву через 5 - 7 днів після передачі.

Культура in vitro. Попередньо μDC відбирали з BM у мишей, оброблених Flt3L, і культивували при 0,5 мільйона клітин на мл, 200 мкл на лунку в 96-лунковому планшеті з плоским дном або 2 мл на лунку в 6-лунковому планшеті в повному обсязі модифікованого Iscove Середовище Деульбекко. (10). % деліпідованої фетальної телячої сироватки, 1 х пеніцилін/стрептоміцин), доповнений 100 нг мл -1 рекомбінантним Flt3L, 10 нг мл -1 рекомбінантним GM-CSF та RA у зазначеній концентрації. ЗМІ змінилися на 3 день.

Описано аналіз активності альдегіддегідрогенази

Мікрочип. Загальну РНК виділяли з отриманих in vitro cDC1 та cDC2 у присутності або відсутності 100 нМ RA, використовуючи метод екстракції фенол-хлороформом, наданий Immgen (//immgen.org). Цілісність РНК визначали за допомогою біоаналізатора Agilent (Stanford PAN Facility, Stanford, CA). Інтактну загальну РНК з кожного зразка використовували для ампліфікації, мічення та гібридизації за допомогою експресійного аналізу. Зразки гібридизували на миші GeneChip Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Санта-Клара, Каліфорнія). Для обробки та аналізу даних мікрочіпів використовували програмне забезпечення GeneSpring GX 12.6 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія) та Partek Genomic Suite (версія 6.6, Сент-Луїс, Міссурі).

Статистичний аналіз. Статистичну значимість відмінностей між двома наборами даних оцінювали за допомогою t-критерію Стьюдента, якщо не зазначено інше.