предметів

реферат

Класична галактоземія - це спадковий рецесивний розлад метаболізму галактози, спричинений дефіцитом ферменту галактоза-1-фосфат уридилтрансферази (GALT), який спричинений мутаціями гена GALT. У цьому дослідженні 56 турецьких пацієнтів з діагнозом галактоземія пройшли скринінг на мутацію генів GALT за допомогою мікрочипів послідовності Affymetrix. У цих пацієнтів було виявлено одинадцять типів мутацій, включаючи дві нові мутації (R258G та G310fsX49) та дев'ять повторних мутацій. У цьому дослідженні ми виявили шість пацієнтів, які були гомозиготними за мутацією E340 * та за тихими замінами N314D, L218L (варіант Duarte-1). Про гаплотипи E340 *, N314D та L218L повідомляли лише у турецьких пацієнтів, що припускає, що мутація E340 * є специфічною для нашого населення і може поширюватися турецьким попередником. Алель Duarte-1 був виявлений у пацієнтів з частотою 10,71%, тоді як алель Duarte-2 не виявлено. Встановлено, що алелі Duarte-1 та Duarte-2 часто виявляються 2,3% та 1,4% при скринінгу 105 здорових людей. З огляду на всі знайдені мутації, дуже важливо виявити, що екзони 6 і 10 гена GALT представляють 79% усіх мутантних алелів у турецькій популяції. Найбільш поширеною мутацією є Q188R з частотою 55, 35%.

високою

Галактоземія - це аутосомно-рецесивний розлад метаболізму галактози, що виникає внаслідок недостатньої або відсутньої активності галактокінази, галактозо-1-фосфат-уридилтрансферази (GALT) та ферментів UDP-галактоза-4'-епімерази, які відіграють роль у метаболізмі галактози в Лелойрі. Переважаючою формою є галактоземія класичного типу, яка спричинена сильним зниженням або відсутністю ферменту GALT і має частоту 1/40 000-60 000 у новонароджених у Європі. Повідомлено про понад 150 мутацій гена GALT. 3

Зниження активності ферменту GALT призводить до накопичення gal-1P в різних органах. Захворювання зазвичай виникає в перші дні життя після прийому грудного молока або продукту. Найбільш ранніми клінічними даними захворювання є блювота, діарея, нездатність до процвітання та жовтяниця. Хоча багато з цих симптомів зникають під час дієти з обмеженим вмістом галактози, довготривалі ускладнення, такі як розумова відсталість, порушення мови чи навчання та передчасна недостатність яєчників у пацієнток-жінок все ще можуть зберігатися. 4

Галактоземія I типу класифікується на важкі класичні та легкі фенотипи Дуарте на основі залишкової активності GALT. Класична галактоземія часто асоціюється з мутаціями S135L, Q188R та K285N в гені GALT. Функціонально нейтральна зміна N314D у гені GALT пов’язана з галактоземією Дуарте і широко поширена серед популяцій у всьому світі. Варіант Duarte-1 має нормальну або підвищену активність ферменту GALT, тоді як варіант Duarte-2 має низьку активність ферменту GALT. Алель Дуарте-1 асоціюється з мутацією N314D, що пов’язує нерівновагу з поліморфізмом L218L. Алель Duarte-2 пов'язаний з мутацією N314D при розв'язанні нерівноваги з трьома інтрональними поліморфізмами IVS4nt-27 g-> c, IVS5nt-24 g-> aa IVS5nt + 62 g-> a та видаленням c-119 -> - 116delGTCA в 5 'неперекладених областях. 6, 7 Тип Duarte-1 не викликає жодних клінічних або біохімічних відхилень, оскільки поліморфізм L218L збільшує швидкість трансляції білка N314D GALT. 5 Делеція 5'-неперекладеної області-119 -> - 116delGTCA в промоторній області гена GALT (варіант Duarte-2) викликає зменшення транскрипції гена GALT. 8

У цьому звіті ми повідомляємо про мутації генів GALT у 56 випадках галактоземії з Туреччини, виявлених шляхом повторної послідовності мікрочипів ДНК. Крім того, 105 здорових осіб пройшли тестування для визначення частоти алельних варіантів Duarte-1 та Duarte-2 у турецької популяції.

Матеріали і методи

пацієнтів

П'ятдесят шість турецьких пацієнтів з галактоземією в Університеті Хачеттепе, департамент педіатрії, відділ метаболізму, були залучені до дослідження з метою виявлення мутацій гена GALT за допомогою методології послідовності мікрочипів. Письмова інформована згода була отримана від усіх залучених сторін. У пацієнтів з класичною галактоземією були характерні такі симптоми, як відмова, блювота, гепатоспленомегалія та печінкова недостатність. Діагноз галактоземії запідозрили знаходженням відновника, який не реагує з реагентами глюкозооксидази, та паперовою хроматографічною ідентифікацією цукру.

Виділення ДНК та ПЛР

Геномну ДНК виділяли з периферійної крові осадженням ацетату амонію. Ген GALT ампліфікували у вигляді двох фрагментів методом ПЛР на великі діапазони з використанням праймерів фрагмента-1F5'-CACGGCCCTGCAGATTTTCC-3 ', фрагмента-1R5'-CTTCATCACCCCCTCCCTGC-3' (довжина продукту ПЛР 1348 bp) та фрагмента-2F5'-CTCTGCAGGC, фрагмент-2R5'-AGTTGTAGCTGGAGCTATGC-3 '(довжина продукту ПЛР 2878 п.н.). Всі праймери були розроблені з використанням програмного забезпечення для аналізу праймерів Oligo (Oligo Version 6.71, Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO, USA). Реакції ПЛР проводили протягом 32 циклів, кожен цикл складався з денатурації при 94 ° С протягом 10 с, відпалу при 60 ° С протягом 30 с і розтягувань при 68 ° С протягом мінімум 5 хвилин, з остаточним продовженням при 68 ° С. протягом 15 хвилин.

Скринінг мутацій

результат

У цьому дослідженні ми повідомляємо про мутаційний аналіз гена GALT, що належить 56 пацієнтам, представленим клінічними даними щодо класичної галактоземії та типу Дуарте-1. Заміни нуклеотидів у гені GALT були виявлені за допомогою мікрочипів послідовностей, за винятком делеції або інсерції змін нуклеотидів. Мутації вставки/видалення були виявлені за допомогою прямого секвенування ДНК. Скринінг мутацій ідентифікував 109 із 112 мутантних алелів у гені GALT. У цих пацієнтів було виявлено одинадцять типів мутацій, включаючи дев'ять повторюваних мутацій (c.425T> C; M142K, c.536G> A; G179D, c.563A> G; Q188R, c.692G> A; R231H, c.855G > T, K285N, c.881T> A, F294Y, c.958G> A, A320T, c.983G> A a; R328H, c.940A> G; E340 *) і дві нові мутації (c.772C> G; А); R258G та c.928delG; G310fsX49). Нова мутація G310fsX49 була виявлена ​​за допомогою прямого секвенування ДНК порівняно з іншими мутаціями.

Сорок дев'ять пацієнтів були гомозиготними, а чотири пацієнти мали гетерозиготну мутацію. У трьох пацієнтів виявлено лише один мутантний алель. Досягнуто рівня виявлення мутації 97,3%. Встановлено, що Q188R є найпоширенішою мутацією в цьому дослідженні з частотою 55,35%. Q188R виявлено в алелях у 29 пацієнтів та в одному алелі у чотирьох пацієнтів. A320T (7, 14%), E340 * (10, 71%) та M142K (6,25%) були визнані другою за частотою мутацією. E340 * був виявлений у шести гомозиготних пацієнтів разом із варіантами N314D та L218L (алель Дуарте-1). Алель Дуарте-1 був виявлений з частотою 10,71%. У цьому дослідженні алель Дуарте-2 не виявлено.

Встановлено, що алелі Duarte-1 та Duarte-2 часто виявляються 2,3% та 1,4% при скринінгу 105 здорових осіб з турецького населення. Всі виявлені мутації та частоти їх алелів зведені в таблицю 1.

Стіл в натуральну величину

обговорення

Це дослідження було проведено на генетичному скринінгу та характеристиці спектру патогенних мутацій гена GALT у 56 випадках галактоземії (50 класичних та 6 типів Дуарте-1). Крім того, були визначені частоти алелів Duarte-1 та Duarte-2 у турецького населення. Опитування в різних популяціях показали, що частота класичної галактоземії становить від 1: 30 000 до 60 000. 2, 3, 11 Однак класична галактоземія була більш поширеною в Туреччині з частотою 1:23 775. 12

По всьому світу в гені GALT описано понад 250 мутацій у різних етнічних популяціях. Ми виявили 11 різних генетичних мутацій, дві з яких були новими, включаючи R258G та G310fsX49. Детальний аналіз впливу мутацій на активність ферментів та структуру білка доступний у попередніх публікаціях. 13, 14 Тут ми обговорили лише можливі наслідки нових мутацій на рівень білка, описаних у цьому генетичному скринінговому дослідженні. Однією з них є нова мутація R258G, яка була виявлена ​​в сполученому гетерозиготному стані з Q188R. Можливо, залишок R258 на поверхні білка бере участь у формуванні сольового містка, змінюючи тим самим поверхневі властивості молекули. Бічний ланцюг залишку гліцину в мутації R258G також дуже малий. Мутація може впливати на склад димеру та стабільність або стабільність мономеру. Мутація зсуву каркасу G310fsX49 призводить до стоп-кодону в амінокислотному положенні 49 позаду видаленого нуклеотиду.

Найбільш поширена мутація Q188R у гені GALT була виявлена ​​у 55,35% населення Туреччини в цьому дослідженні. Наші результати частоти Q188R цього дослідження сумісні з раніше опублікованими дослідженнями у пацієнтів з турецькою галактоземією, які повідомляли про частоту 57% та 47%. 15, 16

Мутація Q188R є найпоширенішим алелем у всіх європейських країнах, і її частота значно варіюється в залежності від популяції. Частота мутацій (від 45 до 93,6%) повідомлялася в наступних країнах у таких випадках: Ірландія, 93,6%; 17 Великобританія, 77%; 3 Португалія, 57,8%; 18 Нідерланди, 58,5%; 19 Іспанія, 50%; 18 Німеччина, 69%; 20 Австрія, 60%; 21 Польща, 51,3%; 22 Чеська Республіка та Словацька Республіка, 46%; 7 та Угорщина, 45%. Як і в цих європейських країнах, було встановлено, що це найпоширеніша мутація хвороб, що спричиняє хвороби, серед турецького населення, і представлені дані підкріплюють спостережувану закономірність, що частота мутації Q188R зменшується із заходу на схід та північ. на півдні на європейському континенті. 24

У цьому дослідженні населення Туреччини K285N зафіксовано лише у 3,57% населення. Мутація K285N є другою за поширеністю мутацією в більшості європейських країн. Частота цього мутантного алелю коливається від 19 до 33,8% у різних європейських популяціях. 7, 20, 21, 22, 23 На відміну від цих високих частот, що спостерігаються і згадані вище, деякі популяції мають низьку частоту алелів цієї мутації, з розподілом між 2, 4 і 9, 8% в європейських країнах. 18, 19, 25

Ці три мутантні алелі A320T (7, 14%), E340 * (10, 71%) та M142K (6,25%) є другими за частотою у турецьких пацієнтів і спостерігаються частіше, ніж в інших популяціях. В інших дослідженнях A320T та M142K були описані як рідкісні варіанти. 26

Наразі спектр мутацій, виявлених у GALT, такий: M142K, G179D, Q188R, L218L, R231H, R258G, K285N, F294Y, N314D, G310fsX49, A320T, R328H та E340 *; всі вони представляють переважну більшість хвороботворних алелей у турецького населення щодо галактоземії через дефекти гена GALT. Більшість хвороботворних варіацій GALT були визначені, і результати цього дослідження сумісні з попередніми результатами. 15, 16

Всі мутації гена GALT збираються в екзонах 5, 6, 8, 9 і 10 гена. Щодо всіх виявлених мутацій, екзони 6 і 10 представляють 79% усіх мутантних алелів у нашій популяції. Важливим спостереженням є більша частота мутацій, розташованих у цих екзонах у пацієнтів з турецькою галактоземією. Ці висновки були б корисними в молекулярно-діагностичних дослідженнях для класифікації алелів з точки зору пріоритетності мутаційного скринінгу серед патогенних мутацій, що спричиняють галактоземію, кількість яких на даний час перевищує 250.

Цікаво, що, як ми вже зазначали в літературі, ми спостерігали, що вісім пацієнтів з мутацією E340 * мали турецьке походження і несли цю мутацію в цис з N314D та L218L. Гатхоф та ін. 27 вперше повідомили про турецького хлопчика з E340 *, N314D та L218L. Шустер та ін. 28 повідомили про двох турецьких братів і сестер та ще одне дослідження Сейрантепе та співавт. 15 з Туреччини згадали ще одного турецького пацієнта з тим самим генотипом; у нашому дослідженні ми виявили шість пацієнтів, які мали мутацію E340 * в цис з N314D і L218L.

Гаплотип E340 *, N314D та L218L, швидше за все, є від предків турків. На закінчення слід визначити походження мутації; однак неможливо продемонструвати підхід, заснований на фактичних даних, до основоположного ефекту гаплотипу в популяції Туреччини за допомогою даних, наявних в даний час від обмеженої кількості пацієнтів.

У цьому дослідженні ми також оцінили наявність варіантів Дуарте у турецькій популяції. Всього 105 здорових (n: 210 алелів) обстежено на наявність варіантів гена GALT Duarte, а загалом 8 N (A8) (3,8%) виявлено на N314D: п'ять (2,3%) визначено як Duarte-1 Варіант і три (1,4%) як варіант Дуарте-2. Частота алеля Дуарте в Європі показала значну різницю залежно від регіону. Розподіл частоти такий: Північна Європа, 7,9%; Східна Європа - 5, 3%; Західна Європа - 6, 1%; і південна Європа - 2,0%. Популяції афроамериканців та азіатців мають меншу частоту алеля Дуарте - 1,3% та 1,5% відповідно. Частота алеля Дуарте в нашій популяції нижча за очікувану (% 3, 8) порівняно зі Східною Європою. Якщо мутація E340 * походить від спільного предка, можливо, цей предок також несе алель Duarte-1, і тому більшість алелей Duarte є разом з E340 *. Однак частота цього алелю у здорових людей нижча, оскільки він не містить хвороботворного гаплотипу для Е340 *. Іншим можливим поясненням різноманітності та відмінностей у розподілі між алелями Дуарте, особливо між загальними мутаціями гена GALT, може бути географічне розташування Туреччини, яка перетинає два континенти, Азію та Європу.

Висока частота виявлення мутації 97,3% була досягнута шляхом застосування мікрочипів із послідовністю послідовностей у цьому скринінговому дослідженні мутацій. Цей метод забезпечує швидкий та економічний підхід до скринінгу на мутації спадкових захворювань. Порівняно з доступними класичними методами генетичного скринінгу, обмеження мікрочипів можна вважати придатним методом з точки зору швидкості, відтворюваності та застосовності для аналізу тисяч нуклеотидів на одній польовій платформі. Це дослідження є першим повідомленням про його використання при генетичному скринінгу у пацієнтів із класичною галактоземією.