генетичні

  • реферат
  • мета:
  • Вивчати дизайн:
  • результат:
  • висновок:
  • вступ
  • методи
  • Статистичні методи
  • результат
  • обговорення

реферат

Оцінити поширеність успадкованих протромботичних мутацій та їх вплив на частоту та тяжкість артеріального або венозного катетера пуповини (UAC або UVC), пов’язаний з тромбозом.

Вивчати дизайн:

У всіх новонароджених з UAC або UVC проспективно вивчали наявність, тяжкість та терміни тромбоутворення за допомогою дуплексного доплерівського ультразвукового сканування. Генетичне тестування на мутації фактора V Leiden (FVL), протромбіну (PTm) та метилентетрагідрофолатредуктази (MTHFR) проводили за допомогою ПЛР рестрикційних фрагментів та аналізів поліморфізму.

результат:

Трамбоз, пов’язаний з пуповинним канатиком (UC), розвинувся у 16/53 (31%) новонароджених; 23% UAC та 22% UVC були пов'язані з тромбозом. Поширеність значної протромботичної мутації була у 10/51 (20%) дітей: FVL (8%), гомозиготність MTHFR667 (10%), гомозиготність MTHFR1298 (2%) та PTm (0%). Пацієнти, які переносять ці протромботичні мутації, не збільшували ризик розвитку тромбу, пов'язаного з UC; наше дослідження мало можливість виявити в 2,5 рази підвищений ризик тромбозу для будь-якої з цих значущих мутацій. Крім того, гетерозиготність MTHFR667 була виявлена ​​у 41% немовлят, а гетерозиготність MTHFR1298 у 52%, і це також не було пов'язано з підвищеним ризиком розвитку тромбу, пов'язаного з UC. Ризик подвійної гетерозиготності MTHFR (db het) становив 14%, ризик значного або db het був 17/51 (33%), а ризик будь-якої мутації становив 90%.

висновок:

Протромботичні генетичні мутації поширені в нашій популяції відділень інтенсивної терапії новонароджених, але, схоже, не збільшують ризик тромбозу, пов'язаного з UC.

Використання пупкового артеріального катетера для новонароджених (UAC) та пупкового венозного катетера (UVC) є звичайною практикою у багатьох відділеннях інтенсивної терапії новонароджених (NICU). Про використання UAC повідомлялося у 10–64% усіх допущених до них інкубаційних служб. 1 Тромбоз як ускладнення UAC є поширеним явищем із частотою від 4,5 до 90%. 2, 3, 4, 5 До ускладнень аортального тромбозу належать ішемія кишечника, гіпертонія, зниження ниркової перфузії, повна оклюзія аорти та застійна серцева недостатність. 6, 7, 8, 9 Застосування ультрафіолетово-ускладнюючих тромбозів також є загальним явищем, із випадками захворюваності від 4,1 до 44%. 4, 10, 11

Ультразвукове дослідження успішно застосовується для виявлення тромбу великих судин. 5, 26 Це безпечний, легкодоступний тест, який можна провести біля ліжка. Оскільки катетери пуповини (UC) мають відносно високу частоту асоційованих тромбозів, ми припустили, що якщо одна або декілька із цих генетичних протромботичних мутацій (FVL, PTm та/або MTHFR) збільшують ризик тромбозу, пов'язаного з UC. Наскільки нам відомо, це дослідження є першим, що досліджує поширеність протромботичних мутацій у популяції NICU, що потребує UC, та їх зв’язок із UC-асоційованим тромбозом.

методи

Це дослідження було перспективним дослідженням, яке проводилось в NICU в жіночій та дитячій лікарні в Баффало з червня 2002 року по лютий 2003 року. Письмова інформована згода була отримана від батьків усіх зареєстрованих дітей. Усі діти, які пройшли успішну UC-рекламу в рамках свого догляду, мали право на включення в дослідження. Рішення про локалізацію або видалення UC було прийнято клінічною групою на основі клінічних показань. Поліуретанові катетери Argyl Neosert 3, 5 або 5 F (Tyco Health Care Group Mansfield, MA, США) використовували для катетеризації пуповинних судин. Усі кінцеві положення UAC були підтверджені рентгенівським променем і знаходились між Т6 і Т9. Наконечники UVC були розміщені безпосередньо над діафрагмою. Всі UAC мали безперервну інфузію гепарину 1 одиниця/мл у половині фізіологічного розчину зі швидкістю 1 мл/год; всі розчини UVC містили 0,5 одиниці/мл гепарину і використовувались для регулярного введення рідини та парентерального харчування.

Всі клінічні та лабораторні дані були зібрані перспективно. Клінічні параметри включали акушерські фактори, наявність хоріоамніоніту, використання пренатальних стероїдів, тип пологів, термін вагітності, вагу при народженні, бал за шкалою Апгар, газ в пуповинній крові, тип і тривалість дихальної підтримки, використання ПАР, епізоди сепсису, некротизуючі епізоди ентероколіт, внутрішньочерепний крововилив, показники артеріального тиску, виділення сечі та загальна тривалість перебування в NICU. На момент отримання згоди сім'ю спеціально запитували про наявність в анамнезі тромбозу глибоких вен, легеневої емболії, інсульту у маленьких дітей та будь-якої сімейної історії спадкової тромбофілії. У минулому не було сімей з цими проблемами. Лабораторні дані включали аналіз крові, азот сечовини в крові, креатинін у сироватці крові, результати дослідження сечі в сечі, посіви крові, дослідження коагуляції та результати рентгенівського та ультразвукового дослідження.

Екстракцію ДНК проводили за допомогою комерційного набору для екстракції (Gentra Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота, США). Окремі ділянки ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та генотипували методом поліморфізму довжини фрагментів рестрикції. Контроль якості складався з трьох контрольних зразків: відомий гомозиготний дикий тип, гетерозиготний, гомозиготний мутант; ці зразки були включені в кожен цикл ПЛР. Генотип FVL був ідентифікований шляхом ампліфікації 287 bp області гена фактора V і згодом перетравлений ендонуклеазою рестрикції MnlI. Ампліфікація MTHFR складалася з 232 п.н. і перетравлювалася Hinf I. Генотип протромбіну визначали шляхом перетравлення 345 п.н. Hind III. Всі розщеплені продукти розділяли гель-електрофорезом на 10% поліакриламіду. Кожен цикл зразків ДНК-учасників містив три послідовні контрольні зразки ДНК та негативний контроль. Всі зразки гетерогенного та гомозиготного мутанта V, протромбіну 20210G> A та MTHFR були повторно виділені та повторно проаналізовані для підтвердження генотипу. Всі зразки аналізували відповідно до нашого посібника з тромбофілії.

Статистичні методи

Розрахунок обсягу вибірки базувався на припущенні, що 22% пацієнтів були б позитивними щодо FVL, PTm або гомозиготного MTHFR677, що є значущими мутаціями (гомозиготний MTHFR1298 був доданий пізніше), і що асоційований з UC тромб виникне у 35% немовлят При α 0,05 та 80% потенції нам потрібно було зарахувати 41 пацієнта (дев'ять випадків (наявна значна мутація) та 32 контролі), щоб виявити 3-кратне збільшення ризику згортання UC у немовлят із будь-яким значущим протромботичним геном. мутації. Для статистичного аналізу використовували STATA (State College, TX, USA). Трохи більше пацієнтів (із схвалення IRB) були включені в дослідження для компенсації проблем із дослідженнями ДНК у зразках крові, оскільки зразки крові дозували до кінця дослідження. Для порівняння безперервних даних використовували t-критерій Стьюдента. Для порівняння категоріальних даних використовували тест χ 2 та точний двосторонній тест імовірності Фішера.

результат

З червня 2002 р. По лютий 2003 р. Було розміщено 159 новонароджених з UAC або UVC або обома, і 70 (на основі відповідної вибірки) попросили згоди. Всього було зараховано 53 пацієнти (рівень згоди 76%); 66% вагітностей були менше 32 тижнів. З 53 суб’єктів 25 мали лише UAC, шість мали лише UVC, а 22 суб’єкти мали UAC та UVC, загалом 47 UAC та 28 UVC. Загалом було проведено 120 ультразвукових досліджень за допомогою доплерографії у 53 пацієнтів. Загалом 16 (31,3%) мали тромб (пов'язаний з UAC або UVC) (табл. 1). Такі характеристики населення, як гестаційний вік, вага при народженні, використання пренатальних стероїдів, показник Апгара, рН шнура, гіпертонія, олігурія, некротизуючий ентероколіт (НЕК), непереносимість їжі, сепсис та тромбоцитопенія не співвідносяться з наявністю тромбозу. Поширеність UAC-асоційованого тромбозу становила 6/24 (25%) у дітей з UAC та без УФК порівняно з 5/23 (22%) у дітей як з UAC, так і з UVC. Поширеність УВЧ-асоційованого тромбозу становила 1/6 (17%) у дітей з УВЧ та без UAC порівняно з 5/22 (23%) у дітей з УВЧ та UAC.

Стіл в натуральну величину

Із 47 дітей з УАК у 11 було артеріальний тромб (23,4%). З 11 пацієнтів з тромбозом UAC троє були великими згустками, п’ять - помірними, а троє малими; жоден з них не залучав ниркові артерії. Жоден з пацієнтів з тромбозом не потребував тромболізису. З цих 11 дітей з аортальним тромбом, без гіпертонії, двоє мали гематурію, і жодне не мало ознак або симптомів гострого судинного компромісу. Було п’ятеро дітей з УАК, які мали гіпертонію, але жодне з них не мало тромбу. З 28 дітей із УВЧ у шести дітей були венозні тромби (21,4%). З шести пацієнтів з УВЧ-асоційованим тромбозом у чотирьох був тромб у IVC, а у двох - у ворітній вені. У всіх цих пацієнтів артеріальний або венозний тромб не виявляли, поки катетер не видалили. Жоден з пацієнтів не потребував лікування, і всі протікали безсимптомно. Ми не спостерігали жодної суттєвої кореляції між будь-яким із досліджених клінічних або лабораторних параметрів та ризиком тромбозу (табл. 1); у дітей із наявним згустком була зафіксована тенденція збільшення частоти олігурії (P-значення = 0,06, точний двосторонній тест Фішера).

Зразки для генетичного тестування були отримані від усіх 53 дітей; однак екстракція ДНК не вдалася у двох пацієнтів (навіть у тромбу). Ми включили всіх 53 пацієнтів для аналізу частоти та факторів ризику тромбозу, але ми проаналізували 51 пацієнта з повними генетичними результатами для аналізу зв'язку тромбозу з протромботичними мутаціями (рис. 1).

Фермент рестрикції засвоюється для ідентифікації мутантного фактора V. Смуги лівої та правої сторін гелю є ДНК-маркерами, що збільшуються на 50 п.н. Доріжки 2-4 є контрольними зразками: (2) нормальні, (3) гомозиготні мутанти та (4) гетерозиготні. Інші п’ять шляхів представляють п’ять результатів для пацієнта: три нормальних дикого типу (вага) і два гетерозиготи (ht) для фактора V 1691 G → A.

Повнорозмірне зображення

Результати генетичного тестування та зв’язок із тромбозом наведені в таблиці 2. Поширеність протромботичних мутацій у гетерозиготному чи гомозиготному стані була загальною і була виявлена ​​у 90% населення. FVL було виявлено у 8% населення. Жодне з дітей не виявило позитивного тесту на протромбін 20210G> A. П’ять пацієнтів були гомозиготними щодо MTHFR667 (10% населення). Один пацієнт був гомозиготним щодо MTHFR1298 (2%). Гетерозиготні MTHFR667 та MTHFR1298 були поширеними, виявлені у 41 та 53% населення. Статистично значущого збільшення ризику тромбозу у пацієнтів із будь-якою з перевірених мутацій не спостерігалося (табл. 2). До того ж висновку дійшли, коли ми аналізували тромбоз UAC та UVC (табл. 3) окремо і коли ми включали лише дітей з мутаціями FVL та гомозиготними мутаціями MTHFR, тобто "значущими мутаціями" та подвійною гетерозиготністю MTHFR (таблиця 2).

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

обговорення

Поширеність FVL у нашій досліджуваній популяції становила 8%, порівняно з опублікованими звітами. 18, 19 Поширеність мутації MTHFR667 у нашому дослідженні становила 41% гетерозиготних та 10% гомозиготних, знову ж порівнянно з раніше опублікованими дослідженнями. 20 Поширеність мутації MTHFR1298 у нашому дослідженні була порівнянна з широким діапазоном, про який повідомлялося серед населення Сполучених Штатів. 33 Попередні дослідження повідомляли про збільшення поширеності мутацій FVL та MTHFR у новонароджених та дітей із тромбозом порівняно із загальною популяцією 16, 34, а також показали підвищений ризик тромбозу, пов’язаного з катетером, у пацієнтів з FVL; 12, 13, однак ми не виявили різниці у поширеності мутацій MTHFR та мутацій FVL у немовлят із тромбозом та без нього.

На закінчення слід сказати, що тромбоз, пов’язаний з UAC та UVC, був поширеним (23 та 21%) і був по суті безсимптомним та клінічно несподіваним. Примітно, що в цьому дослідженні всі тромбози були виявлені після видалення катетера. Виникнення протромботичних генетичних мутацій є загальним явищем у нашій популяції NICU, але, схоже, не збільшує ризик тромбозу, пов’язаного з UC.