предметів

реферат

У нашому дослідженні дистахіон брахіподіум, невелика однорічна трава з глобулінами, використовувався для зберігання насіння як основний запас білка для аналізу токсичної природи білків, що зберігають непроламінові насіння, пов’язані з целіакією. Основними білками для зберігання B. distachyon є 7S білки типу глобуліну та 11S, 12S глобуліни для зберігання насіння, подібні до вівса та рису. Були проведені імуноблот-аналізи з використанням зразків сироватки у хворих на целіакію з подальшим виявленням імунно-реагуючих білків за допомогою мас-спектрометрії. В якості контролів використовували зразки сироватки у хворих на целіакію, які не містять глютену, від хворих на хворобу Крона та здорових людей. Ідентифіковані білки з інтенсивною реакційною здатністю IgA в сироватці крові належать до сімейства глобулінів 7S та 11–12S. Структурні прогнози та аналізи прогнозування епітопів підтвердили наявність лінійних В-клітинних епітопів, пов’язаних із целіакією, та наявність пептидних областей із сильними здатностями зв’язувати HLA-DQ8 та DQ2. Ці результати вказують на те, що як представлення MHC-II, так і відповідь В-клітин можуть розвиватися не тільки для проламінів, але і для глобулінів, що зберігають насіння. Це перше дослідження білків брахіподію для зберігання насіння непроламінового типу з точки зору целіакії.

Імунореактивні пептиди білків, що зберігаються проламінового типу, таких як злаки, такі як пшениця, жито та ячмінь, спричинюють появу молекул при розвитку целіакії (ЦД), системного аутоімунного захворювання, що спричиняє атрофію ворсинок у тонкому кишечнику. Целіакія має сильний генетичний компонент і зустрічається лише у осіб, що несуть гаплотипи DQ2.5, DQ8 або DQ2.2 людського лейкоцитарного антигену (HLA), які діють як рецептори поверхні клітини токсичних пептидів на клітині, що представляє антиген. Дезамідація пептидів гліадину пшениці шлунковою кислотою або певними ферментами (наприклад, основним целіакічним аутоантигеном, трансглютаміназа типу 2) сильно посилює їх імуногенні властивості, належним чином залучаючи їх у канавки, що зв'язують DQ2 і DQ8. Антитіла проти цих дезамідованих антитіл до гліадинового пептиду (DGP) мають вищу діагностичну цінність, ніж звичайні антигліадінові антитіла (AGA) 1, 2. Сьогодні єдиним ефективним способом лікування є безглютенова дієта, яка часто багата рисом, кукурудзою, лободою, теффом або амарантом. Загальною особливістю цілісних зерен є те, що їх насіння багаті глобулінами для зберігання замість білків для зберігання проламіну.

Матеріали і методи

Пацієнти та сироватки

Зразки сироватки у хворих на целіакію з відомими гаплотипами HLA-DQ та позитивними на антицеліакічні антитіла до споживання глютену (n = 13, 8 жінок, 5 чоловіків), середній вік 5, 7 років, діапазон 1, 4–13, 5 років) Зразки сироватки у пацієнтів з целіакією на суворій безглютеновій дієті (GFD), що призводить до нормалізації антитіл (антитрансглютаміназа IgA 200 Од/л) 11, 12. Шість хворих на целіакію були HLA DQ2, 5 гомозиготними; п'ять були гомозиготними DQ8, а один - гетерозиготним (DQ8/X). Точний результат набору DQ в одному випадку не був доступний. В одному випадку DQ8 розвинувся цукровий діабет 1 типу через два роки після діагностики целіакії. Батьки надали письмову інформовану згоду на забір сироватки крові. Усі методи вербування, збору даних та експериментів проводились відповідно до відповідних керівних принципів та норм. Усі експерименти були схвалені комітетом з етики Дитячої лікарні Хайма Паля, Будапешт та Регіональним та інституційним комітетом Університету Земмельвейса та дослідницької етики. Зразки сироватки відбирали під час діагностичної процедури целіакії для клінічних випробувань целіакійних антитіл відповідно до керівних принципів ESPGHAN і пізніше використовували для експериментів, затверджених Комітетом з етики дитячої лікарні Хайм Пал, Будапешт.

Екстракції білка

Загальний білок 50 мг подрібненого насіння Bd21, інбредного B. distachyon, екстрагували згідно з протоколом Dupont et al. Коротко, екстракційний буфер SDS-Tris (pH 6, 8), що містить 2% SDS, 10% гліцерину, 50 мМ DTT і 40 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 8, використовували для вилучення загального білка при кімнатній температурі протягом однієї години з регулярним ніжний вихор. Екстракт центрифугували при 16000 g протягом 15 хвилин. Супернатант осаджували чотирма обсягами крижаного ацетону. У процесі екстракції було використано п’ять біологічних копій.

Двовимірний гель-електрофорез та імуноблотинг

Після осадження гранулу розчиняли буфером IEF (8 М сечовини, 2% CHAPS, 100 мМ DTT, 0,2% CA і 0,1% бромофенолового синього). Ізоелектричне фокусування проводили в 7 см Immobiline DryStrips рН 3 - 10 (GE Healthcare) в умовах нічної регідратації з 200 мкг білка в 150 мкл буфера IEF. Для розділення білків на основі їх молекулярної маси використовували 12% поліакриламідні гелі. 2D GE був виготовлений у трьох технічних копіях. Оскільки всі структури 2D-білків з різних біологічних та технічних повторностей були однаковими, остаточний онлайн-нано-LC-MS/MS був підготовлений з трьох технічних повторень 2D GE і плями об’єднали.

Після 2D-білків GE переносили на мембрану PVDF ImmobilonP (Millipore, Billerica, США) і блокували протягом 1 години 5% BSA та 0,05% TWEEN20, з подальшою інкубацією протягом ночі при 4 ° C з розведеною сироваткою крові 1:20. Імунореактивні білки виявляли за допомогою кон’югованого з пероксидазою антитіла IgA людини, виробленого у кіз (Sigma-Aldrich-A0295) у присутності хромогенного пероксидазного субстрату 4-хлор-1-нафтолу. Імуночутливі білкові плями вирізали та направили на ідентифікацію білка за допомогою он-лайн нано-LC-MS/MS. Рисові антитіла до глютеліну, поєднані з анти-кролячим IgA як вторинним антитілом, використовували в 2D-аналізі вестерн-блот, щоб підтвердити наявність глобулінів, що зберігають насіння 14 .

Ідентифікація білків on-line нано-LC-MS/MS

Аналіз послідовності та прогнозування епітопу

результат

білків

( A ) - 2D гель-електрофорез загального білкового екстракту інбредної лінії Bd21. Білки відокремлювали на смужках IPG від 3 до 10 рН з подальшим розділенням на 12% акриламідних гелях. Помічені білкові плями представляють імунореактивні білки і були представлені для онлайн-аналізу nanoLC-MS/MS. Діапазон молекулярних ваг позначений зліва. ( B до F ) - репрезентативні імуноблоти, що використовують сироватку з реактивністю IgA при лікуванні пацієнтів без попередньої целіакії ( B - HLA DQ2, C. - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), лікування ілеокольної хвороби наївного пацієнта з хворобою Крона ( Е ), HLA Пацієнт з целіакією DQ2 на безглютеновій дієті та здоровому контролі G ). H- Вестерн-блот-аналіз загального екстракту білка проводили з використанням антитіл до рисового глютеліну 12 та IgA проти кролика (Sigma-Aldrich) як вторинного антитіла.

Повнорозмірне зображення

Стіл в натуральну величину

Два пункти глобулінів 7S (Uniprot ID I1GPS5 та I1GMC8) були ідентифіковані переважно з місць. I1GPS5 був визнаний основним ураженням 14 білкових плям. Цей білок продемонстрував найбільшу схожість з гомологами білків пшеничного резервуару Globulin-3 та Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 та I6QQ39). I1GMC8 був виявлений у двох білкових плямах і продемонстрував найбільшу подібність послідовності до білка типу Globulin 1S, виявленого з Triticum urartu (M7ZQM3). Білок брахіподію I1HNH9 виявив найвищу гомологію до 11S глобуліну (A. sativa Q38780). Білки I1HMK7 та I1IPF2 були ідентифіковані як 12S глобуліни, з найсильнішою подібністю до білків зберігання насіння 12S у A. sativa (P12615 та P14812). Сироватки найчастіше реагували на гомолог резервуару білка пшениці Глобулін-3А (69, 23% - I1GPS5) та глобуліни типу 11S та 12S (76, 92% - I1HNH9 та I1HMK7). Низькомолекулярний гомолог глютеніну (69, 23% I1HMR6) також був високо імунно реагуючим на сироватки у хворих на целіакію.

Щоб продемонструвати присутність глобулінів для зберігання насіння в імунно-реактивних білкових плямах, проводили Вестерн-блот-аналіз з використанням первинних антитіл, специфічних для рисових глютелінів, гомологів глобулінів для зберігання насіння рису 11S (рис. 1Н). Сильні сигнали глобуліну були виявлені з білкових місць з ідентифікаторами 1-14 та 22-28.

Найбільш важливі влучення глобуліну (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2I1HNH9), а також найбільш часто ідентифікований білок проламіну (I1HRM6) були піддані прогнозуванню структури за допомогою аналізу in-silico. Два суміжні домени купін-1, характерні для глобулінів для зберігання насіння 7S та 11S - 12S, були знайдені у всіх потрапляннях глобуліну брахіподіум (рис. 2). У більшості аналізованих білків глобуліну були виявлені регіони з можливими здатностями зв'язування зі структурованими білковими партнерами 22. На межі впорядкованих областей розладів у глобулінах 7S-типу (I1GPS5 та I1GMC8) були виявлені сильні області зв’язування, тоді як у 11S та 12S-глобулінах виявлені значно слабкіші ділянки зв’язування, а в проаналізованому проламіну брахіподію жодної області зв’язування не виявлено. послідовність. (Рис.2)

Повнорозмірне зображення

Десять амінокислотних довгих пептидів з більш ніж 70% гомологією послідовності до В-клітинних специфічних лінійних епітопів глютену були ідентифіковані в безпосередній близькості до зв’язуючих з білками I1GPS5 областей (Таблиця 2). Ідентифіковані гомологи епітопів були пептидами з областями polyQ і знаходились у двох регіонах багатого глютаміном білка. Далі, пептид довжиною у шість залишків (QPEQPF) був ідентифікований у глобальному гені зберігання насіння 11S, 11HNH9. Цей пептид являв собою знезаражену версію відомого імунореактивного AGA-специфічного В-клітинного епітопу QPQQPF (IEDB Epitope ID 147232), який дезамідується під час процесу целіакії. Ця дезамідована версія являє собою одну з основних цілей сироваткових антитіл до DGP при целіакії. Цікаво, що жоден з гомологів I1HNH9 Poaceae не містив цього дезамідованого пептиду. У білках, пов’язаних із метаболізмом, не виявлено гомологів епітопів.

Стіл в натуральну величину

Відбір передбачуваних зв'язуючих агентів проводили з використанням верхніх 1% зв'язуючих речовин на основі консенсусних значень процентиля. Прогнози розраховували для кожного алеля окремо. Прогнозовані епітопи наносяться на білкові послідовності.

Повнорозмірне зображення

Третинна структурна модель мономеру глобуліну ISGPS5 7S була створена з використанням загальнодоступних кристалічних структур 7S глобулінів, виділених із рослин. Ідентифіковані специфічні для глютену гомологи В-клітинних епітопів, які знаходяться в послідовності приблизно на 350 відстанях амінокислот, були зіставлені у безпосередній структурній близькості. Один з гомологів епітопу В-клітин розташований на зовнішній поверхні бета-бочки, утвореної другим доменом купін-1. Прогнозовані HLA-DQ-специфічні Т-клітинні епітопи та ідентифікований епітоп діабету типу I знаходились на протилежному ділянці молекули білка, який також потенційно піддається дії травного ферменту (рис. 4А, В, С). Для насіння 11SHHHHHHHHHHHHHHH передбачуваний епітоп DQ2 знаходився у похованому положенні, тоді як гомолог B-клітинного епітопу QPEQPF розташований на поверхні білка (рис. 4D та E).

Структури мономерних глобулінів моделювались із використанням загальнодоступних рослинних ортологів як структурних шаблонів та сервера для прогнозування структури та функції білка I-Tasser. Положення ідентифікованих клейковинних гомологів В-клітинних епітопів та передбачуваних HLA-специфічних Т-клітинних епітопів DQ2 та DQ8 були зіставлені зі структурою. ( A - C. ) I1GPS5; ( D, Е ) 11HNH9.

Повнорозмірне зображення

обговорення

На підставі наших попередніх досліджень, велика кількість злакових білків може містити пептиди, багаті проліном та глутаміном, що робить їх мішенню для антигенпрезентативних клітин, що представляють целіакію, та імуноглобулінів 10, 15, 24. У пшениці більшість цих білків належать до надродини проламіну і є природною сполукою пшеничної клейковини. Однак існують також білки непроламінного типу, які також містять пептиди, ідентичні або сильно схожі на специфічні для глютену Т-клітинні епітопи та В-клітинні епітопи 10, 15 .

Наше дослідження підтвердило, що білки зернових культур насіння глобуліну специфічно асоціюються з целіакією, оскільки пацієнти, які страждають на інші імунологічні запальні захворювання, такі як хвороба Крона, не розпізнавали ці білки для зберігання злакових культур типу глобуліну. Несприятливі результати імуноблот-аналізів із сироватками крові хворих на целіакію на безглютеновій дієті також підкріпили гіпотезу про те, що глобуліни, що зберігають насіння, можуть діяти як вторинні стимулятори В-клітин завдяки своїй сильній гомології послідовності з епітопами, отриманими з первинних тригерів глютену. На прогресуючих стадіях захворювання атрофія ворсин і підвищена проникність кишечника сприяють тому, що ці білки можуть служити перехресними антигенами. Відновлена ​​слизова оболонка кишечника пацієнта з целіакією на суворій безглютеновій дієті перешкоджає кращому проходженню проглочених білків і, можливо, таким чином можна контролювати сильну імунну реактивність.

$ config [ads_text16] не знайдено

висновки

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Гелл, Г. та співавт. Характеристика білків для зберігання глобуліну низькопроламінних видів злаків щодо целіакії. Наук. Респ. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

Примітка видавця: Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог опублікованих карт та інституційних відносин.