предметів

реферат

Цікаво, що, схоже, aS та a70 розпізнають дуже подібні промоторні послідовності 6. Як результат, декілька промоторів розпізнаються з подібною силою як за допомогою EσS, так і Eσ70 in vitro 7, а їх переважне розпізнавання однією формою РНК-полімерази in vivo опосередковується білками-допоміжними регуляторами 6. Вибіркове розпізнавання промотору за допомогою 70 або oS може бути досягнуто шляхом відхилень від загальної консенсусної послідовності 6, 8, що надає специфічність для одного фактора σ: наприклад, наявність нуклеотиду С (-13C) безпосередньо перед −10 промотор Цей елемент є відомим детермінантом для σ-зв'язування S a є загальною ознакою в σ S 9-залежних промоторах. У попередній роботі ми зосередилися на визначенні, які промотори переважно пов'язані in vitro або Eσ 70, або Eσ S за допомогою мікрочипів (RCA); ми підтвердили важливість елементів послідовності, важливих для розпізнавання промотора σS, таких як наявність залишків С у положеннях -13 та -12 елемента С, і припустили, що багата на А/Т область дискримінатора сприятиме ініціації транскрипції Eσ S in vitro 10 .

У цій роботі ми використовували хроматин-імунопреципітаційне секвенування (ChIP-seq) для ідентифікації Eσ-зв'язаних промоторів на ранній стаціонарній фазі, тобто в той момент, коли σS накопичується всередині бактеріальної клітини. Наші результати призвели до ідентифікації нових σS-залежних генів та дали розуміння регуляції некодуючих РНК σS. Ми також можемо показати, що значна підгрупа зв'язаних з EσS промоторів рухає гени, експресія яких не залежить від S-S, що свідчить про значне перекриття розпізнавання промоторів різними σ-факторами.

результат

Конструювання MG1655-rpoS His6 та імунопреципітація aS-His6

ядерного

A. Криві зростання в середовищі LB із штамів MG1655 (кола) та MG1655- rpoS His6 (алмази). Внутрішньоклітинна кількість aS (для MG1655) та aS-His6 (для MG1655-rpoS His6), визначена за допомогою Вестерн-блот на початку стаціонарної фази (точки 1 і 2 на графіку), показана у вставці. B. Питома активність каталази HPII у MG1655, MG1655- rpoS His6 та у штамах MG1655A rpoS. Значення трьох незалежних експериментів були проаналізовані ANOVA; літери позначають зразки, що демонструють статистично значущі відмінності. C. Визначення відносного представлення області промотору dps в імунопреципітованій (IP) версії вхідного зразка методом RT-PCR. Дані є середнім значенням для двох повторень з однаковими результатами.

Повнорозмірне зображення

Імунопреципітаційне секвенування хроматину (ChIP-seq)

Стіл в натуральну величину

Сині профілі показують IP-щільність та профілі вхідних тегів для відомих генів osmB, dps, osmE та csrA ( A ) залежно від rpoS та для локусів, пов'язаних з некодуючими РНК sibC/ibsC, ryeA/ryeB та omrA/omrB ( B ). Червоні профілі показують сигнал log2 для перевірки значень оцінки збагачення, отриманих spp (піками) для тих самих генів та некодуючих РНК. Значення на осі X - це геномні координати піків; показано представлення відповідних генів/міжгенних областей, отриманих від Ecocyc (ecocyc.org).

Повнорозмірне зображення

Переважна більшість (63 з 78) піків oS-IP були розташовані безпосередньо перед кодуючими послідовностями або відомими регуляторними РНК, що відповідає зв'язуванню aS з промоторними областями. З цих 63 піків 61 знаходився в міжгенних регіонах, тоді як два піки лежали в ORFs stfR і wbbH, але вище за течією, відповідно, гени tfaS і wbbI, припускаючи, що вони можуть визначати внутрішні промотори в оперонах. Інші піки потрапляли в інтрагенні регіони на значній відстані від інших ОРВ (перелічені в додатковій таблиці S2). Хоча можливо, що деякі з цих піків можуть визначати добросовісні сайти зв'язування Eσ S (наприклад, промотори для ще невідомих антисмислових РНК), у цьому дослідженні їх не розглядали для подальшої характеристики. Однак, навіть припускаючи, що всі внутрішньогенні піки є артефактами ChIP-seq, отриманий відсоток хибнопозитивних результатів (19%) все одно буде нижчим, ніж той, що повідомлявся для подібних досліджень 13 .

50 із 63 піків, що відповідають відомим або передбачуваним регіонам промотору, можуть бути однозначно присвоєні одному конкретному гену на основі послідовності ДНК, охопленої піком, напрямку транскрипції сусідніх генів, відстані до найближчих ORF і якщо експериментально визначена транскрипція стартовий сайт в межах піку. З 50 однозначно ідентифікованих генів 27 було показано, що принаймні частково залежать від rpoS у попередніх звітах, як показано в таблиці 1. На відміну від цього, 13 піків, перелічених у таблиці 2, лежать в міжгенних областях між різнотранскрибованими генами або оперонами. І не може бути пов'язана з певним геном. Однак ми часто виявляли, що один із двох різнорідних генів (або навіть обох, як у міжгенній області dsrB-yodD, Таблиця 2) раніше описувався як rpoS-залежний, припускаючи, що зв'язування EσS було обумовлено наявністю rpoS- залежний промотор в міжгенній області. Як приклад, ми призначили передбачуваний сайт зв'язування EσS в міжгенній області osmE-nadE для osmE, оскільки його промотор залежить від aS-14, 15, 16 (рис. 2 і таблиця 2).

Стіл в натуральну величину

Загалом, піки, виявлені в експерименті з ChIP-seq, збігалися з промоторами 36 генів, які, як було показано, принаймні частково залежали від rpoS (виділено в таблицях 1 та 2). Гени стресу, залежні від стресу, визначили найбільш відому функціональну категорію в нашому аналізі ChIP-seq (див. Таблиці 1, 2), що узгоджується з роллю σ S як головного регулятора загальної реакції на стрес. Цікаво, що сайти зв'язування EσS також були знайдені за кількістю генів, що беруть участь у структурі клітинної оболонки (erfK, lpp, ynhG) та біогенезі ліпополісахаридів (LPS) (lpxC, wbbH, wbbI), що припускає, що Eσ S може бути важливим для експресії. гени клітинної поверхні у відповідь на зупинку росту.

Стіл в натуральну величину

Більшість міжгенних областей, які не асоційовані з rpoS-залежними генами, включали відомі або передбачувані промотори, розпізнані за допомогою Eσ 70, що узгоджується з попередніми результатами, що свідчать про широке перехресне розпізнавання між регуляторами EσS та Eσ 70 7, 9. Цікаво, що інші промотори також розпізнаються за іншими альтернативними факторами σ, а саме σE (ytfJ та lpxP) та σH (hepA, sdaA, raiA та rpmE) (таблиці 1, 2,).

Стіл в натуральну величину

Експресія in vivo генів, виявлених за допомогою ChIP-seq аналізу

Результати експериментів qRT-PCR (рис. 3) можуть продемонструвати rpoS-залежну експресію генів для dps, ycgB, ybiI та ydbK, припускаючи, що останні два є неідентифікованими членами регулона rpoS. На відміну від цього, на експресію решти генів дефіцит функціонального гена rpoS не впливав, принаймні за випробуваних умов. Для подальшого вивчення того, чи виявляли ці гени залежність від oS, ми протестували рівні їх експресії у rpoS-супресивному штамі (MG1655/pBADrpoS), вирощеному до ранньої стаціонарної фази в середовищі LB, доповненій 0,1% арабінозою. Незважаючи на те, що внутрішньоклітинна кількість aS була майже в 10 разів вищою у штамів, що несуть pBADrpoS, порівняно з MG1655, суттєвих змін рівня відносної експресії не виявлено для жодного з перевірених генів (дані не показані).

A. Аналізи затримки гелю, проведені в гепариновому буфері K-глутамату. B. Аналізи реактивності KMnO 4: Обидві форми РНК-полімерази EσS та Eσ70 тестували при 50 нМ. Для кожної панелі перша смужка - маркер молекулярної маси, отриманий як послідовна реакція G + A фрагмента ДНК. C. Послідовність нещодавно ідентифікованих промоторів bsmA, ybiI та ydbK. Послідовності перераховані від позиції -17 до +10 відповідно до місця початку транскрипції (TSS), позначеного "+1", і зазначеного жирним шрифтом. Елемент промотора -10 підкреслено. Залишки тимідину, що реагують на KMn04, у ланцюжку матриці (позначені як 32 P), реактивні в аналізах KMn04, позначені жирним шрифтом.

Повнорозмірне зображення

Регуляція некодуючих РНК за допомогою Eσ S

A. Північна блот-гібридизація. РНК екстрагували на початку стаціонарної фази (OD600 нм 3) з бактерій, вирощених у LB, або при 28 ° C, або при 37 ° C, і досліджували рівні транскриптів SibC, OmrA та RyeA (зліва направо). Цифри на правій стороні кожної панелі вказують на розмір відповідної ncRNA. Гелі досліджували для бажаних генів, потім зонд видаляли промиванням, а гелі повторно досліджували на рівні 5S РНК, яку використовували як внутрішній контроль. B. Відносна флуоресценція транскрипційних злиття промоторів omrA та omrB до репортерного гена GFP. Активність промотору (суцільна лінія) виражається як співвідношення між флуоресценцією та поглинанням культури (пунктирна лінія) після корекції фону (RFU/OD600 нм). C. Ефекти заміщення -12C на нуклеотид Т в промоторній області omrA. Дані були взяті з культур за ніч і є середнім показником чотирьох незалежних експериментів.

Повнорозмірне зображення

Аналіз послідовності S-S-зв'язаних промоторів

Weblogo 3 (//weblogo.threeplusone.com/) представлення вирівнювань послідовностей для експериментально ідентифікованих промоторів, розташованих у місцях зв'язування Eσ S - вирівняно 10 областей або σS-залежних генів (верхня панель), або σS-незалежних генів (нижня панель) з цього випливає, що перший нуклеотид -10 гексамера був встановлений у положення -12. Послідовності промотору наведені в таблиці S3.

Повнорозмірне зображення

обговорення

Стіл в натуральну величину

Також виявляється, що перехресне розпізнавання промотору oS поширюється на альтернативні фактори σE та σH (таблиці 1, 2,) згідно з попередніми результатами, які показують подібні функції регуляторів rpoE та rpoS, а деякі промотори накладаються між ними σ. фактори in vitro 10, 34. Дійсно, наші результати підтверджують сильну взаємодію між aS та aH, оскільки промотор rpoH безпосередньо розпізнається EσS (табл. 1), що узгоджується з його вираженим rpoS виразом 35. Наші результати будуть узгоджуватися з нещодавніми звітами, що демонструють спільну регуляцію регуляторів rpoE, rpoH та rpoS у відповідь на осмотичний стрес у ентеропатогенних E. coli O157: H7 36 та розгорнутий аналіз σ-факторної мережі у E. coli, що показує значне перекриття розпізнавання промотора за альтернативою σ становить 33 .

Стіл в натуральну величину

Стіл в натуральну величину

Хоча реакції на стрес є добре відомими прикладами генних функцій, пов'язаних з регулятором rpoS, наші результати свідчать про безпосередню участь oS у експресії генів, що беруть участь у біогенезі та структурі LPS та білків зовнішньої мембрани (таблиці 1, 2,). Відомо, що зміни структури будови клітинної поверхні та їх складу відбуваються у стаціонарній фазі 38. Згідно з нашими результатами, крім генів LPS Eσ S, ChIP-seq також зв'язується з промотором lpp, кодуючи Lpp або ліпопротеїн Брауна, який пов'язує зовнішню мембрану з пептидогліканом і є найпоширенішим ліпопротеїном, асоційованим із зовнішньою мембраною в E . coli 21. Хоча експресія гена lpp не залежить від гена rpoS (рис. 3), асоціація гена rpoS з функцією ліпопротеїнів Брауна додатково пропонується шляхом ідентифікації двох додаткових сайтів зв'язування EσS перед генами erfK та ynhG, що кодують дві з чотирьох альтернативних транспептидаз що зшиває Lpp з пептидогліканом. І гени erfK, і ynhG були описані як rpoS-залежні 15, 16. Таким чином, виявляється, що при вступі в стаціонарну фазу росту rpoS може знадобитися для підтримки активності Lpp-транспептидази в периплазматичному просторі.

Стіл в натуральну величину

Нарешті, наші результати вказують на пряму роль Eσ S у точному регулюванні регуляції некодуючих РНК: наприклад, Eσ S сприяє транскрипції omrA, але не прикордонного гена, omrB (рис. 5). Обидва гени кодують дуже схожі некодуючі РНК, орієнтовані на ті самі гени. Здається, що різна залежність від EσS цими двома промоторами може розвинутися, щоб забезпечити диференціальну експресію некодуючих РНК OmrA та OmrB у відповідь на різні сигнали, причому OmrA індукується як частина регулона rpoS. Результати мутагенезу в положенні -12 промотору omrA сильно підкріплюють уявлення про те, що нуклеотид -12C може сприятливо впливати на ініціацію транскрипції Eσ S у кількох промоторах 39. Оскільки як OmrA, так і OmrB РНК впливають на трансляцію кількох білків зовнішньої мембрани та позаклітинних структур, таких як кучері та джгутики 40, їх селективна регуляція може опосередковувати вплив Eσ S на ці структури, сприяючи загальній реорганізації поверхні бактеріальної клітини в відповідь. до стаціонарної фази.

методи

Натяжна конструкція

імунопреципітація s-His6

ДНК з необробленої MG1655-rpoS His6 обробляли ультразвуком і 200 мкл використовували як контроль у реакціях секвенування (Вхід = неімунопреципітована ДНК). Вхідні та імунопреципітовані зразки ДНК аналізували за допомогою біоаналізатора Agilent, використовуючи набір ДНК із високою чутливістю (Agilent Technologies). П'ять зразків ІР об'єднували на одній колонці для очищення ДНК (minElute, QIAGEN), щоб отримати 5 нг загальної ДНК, що є мінімальною кількістю для підготовки бібліотеки послідовностей. Було зроблено два набори IP ДНК. До побудови бібліотек послідовностей проводили кількісну кількісну ПЛР зворотної транскриптази (qRT-PCR) для визначення збагачення rpoS-залежної промоторної області гена dps в імунопреципітованих зразках порівняно з вхідною пробою. Послідовності праймерів, що використовуються для qRT-PCR, перелічені в Додатковій таблиці S1.

Процедура підготовки та послідовності бібліотеки

Бібліотеки Illumina готували або з 5 нг кожного з двох пулів імунопреципітованої ДНК (RpoS-IP), або з 5 нг двох контрольних ДНК (вхід) згідно з набором для підготовки зразків ДНК Illumina TruSeq ChIP-seq; потім кожну бібліотеку секвенували в одноланцюговій 51-бітній просвічуванні Illumin на секвенсорі GAIIx. Вихідні дані є загальнодоступними в архіві Sequence Reads під номером підключення BioProject SRP041323; BioSample SRS595203; Експеримент SRX523029; Run1 SRR1265068; Запуск2 SRR1271103.

Статистичний та біоінформатичний аналіз даних

Сирі цифри були зіставлені з геномом кишкової палички MG1655 за допомогою Bowtie 45 з нульовим невідповідністю. Отримані файли BAM були оброблені за допомогою SAMtools 46 та BEDTools 47. Якість кожної послідовності зразка перевіряли за допомогою взаємокореляційного аналізу, реалізованого в пакеті spp R 48. Піковий дзвінок ChIP-seq здійснювався за допомогою CisGenome 12 шляхом збереження стандартних параметрів. Вхідні дані (контрольна ДНК) використовувались для моделювання фонового шуму.

Визначення rpoS-залежної експресії генів in vivo

Для всіх експериментів з експресією генів штами бактерій вирощували в середовищі LB до OD600 нм = 3,0.Для qRT-PCR екстрагували РНК і проводили експерименти, як описано вище, використовуючи 16S РНК як еталон. Праймери, використані в експериментах qRT-PCR, перелічені в Додатковій таблиці S1. Для вестерн-блотингу загальну РНК екстрагували гарячим фенолом для збереження невеликих молекул РНК. Перед електротрансфером на нейлонову мембрану на 6% денатураційному акриламідному гелі відокремлювали 5-20 мкг РНК. Як генноспецифічні зонди 5'-біотинільовані олігомери (Додаткова таблиця S1) при 1 нМ використовувались у поєднанні з 20 рМ зондами 5S РНК як внутрішній контроль. Насичення та гібридизацію проводили за допомогою буфера ULTRAhyb®-оліго (Ambion) при 45 ° C, а сигнали виявляли за допомогою модуля виявлення нуклеїнової кислоти Chemi (Thermo Scientific Pierce). Аналізи GFP-репортерів проводили, як описано вище 50 .

РНК-полімераза in vitro

Відновлення РНК-полімерази, зсув гелю та реактивність KMnO 4 проводили, як описано вище 32. 32 Р-мічену ДНК готували методом ПЛР після 5'-фосфорилювання праймера, комплементарного кодуючому ланцюгу (див. Додаткову таблицю S1), для отримання лінійних фрагментів ДНК приблизно 250 п.н., як правило, що містять перші 10 кодонів гена та 220 п.н. ДНК вище за течією, включаючи промоторну область. Для аналізів зміщення рухливості гелю (GMSA) комплекси між відновленою РНК-полімеразою (18-150 нМ) і ДНК (1 нМ) утворювались протягом 15 хвилин при 37 ° C в буфері K-glu100 (40 мМ HEPES, pH 8,0, 10,10) мМ хлориду магнію, 100 мМ глутамату калію, 4 мМ дитиотрейтолу (DTT) і 500 мкг/мл бичачого сироваткового альбуміну) в кінцевому реакційному об'ємі 10 мкл. Реакційну суміш завантажували на 5% нативного поліакриламідного гелю після додавання 2,5 мкл збагаченого гепарином буфера для завантаження 32, і гель-електрофорез проводили в буфері 0,5xTBE при 120 В. Експерименти проводили принаймні двічі і давали дуже подібні результати.

Для тестів на реакційну здатність KMnO 4 50 нМ кожної форми РНК-полімерази (EσS та Eσ 70) інкубували з приблизно 3 нМ міченою ДНК-промотором протягом 20 хвилин при 37 ° C в буфері K-glu100 без DTT, щоб утворити комплекс. KMnO 4 додавали до кінцевої концентрації 10 мМ і реакцію зупиняли через 30 секунд додаванням 2 мМ DTT. Зразки екстрагували фенолом і осаджували, обробляли 1 мМ піперидином, ресуспендували у чистому блакитному формамідно-синьому кольорі перед завантаженням на 7% -ний поліакриламід-денатурирующий гель. ДНК-сходи генерували для кожного міченого фрагмента ДНК шляхом часткового послідовності G/A з використанням мурашиної кислоти та піперидину.

Інші методи

Визначення активності каталази HPII та експерименти Вестерн-блот проводили, як описано раніше 51, 52. Мутагенез промотору omrA проводили шляхом генерування продуктів ПЛР з мутагенними праймерами, які несли бажані заміни, як описано вище. .

Детальніше

Як цитувати цю статтю: Peano, C. та співавт. Характеристика ядерного регулону Escherichia coli σ S методом хроматинового імунопреципітаційного секвенування (ChIP-seq). Респ. 5, 10469; doi: 10.1038/srep10469 (2015).

Додаткова інформація

Файли PDF

Додаткова інформація

Коментарі

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь дотримуватися наших Загальних положень та умов та Правил спільноти. Якщо ви вважаєте, що це образливий вчинок, який не відповідає нашим умовам чи інструкціям, повідомте про це як про недоречний.